Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com. Útgáfan af vafranum sem þú notar hefur takmarkaðan CSS-stuðning. Til að ná sem bestum árangri mælum við með að þú notir nýrri útgáfu af vafranum þínum (eða slökkvir á samhæfingarstillingu í Internet Explorer). Á meðan, til að tryggja áframhaldandi stuðning, sýnum við síðuna án stíl eða JavaScript.
Uppgötvun og gagnleg notkun náttúruafurða getur hjálpað til við að bæta líf manna. Efni sem hamla vexti plantna eru mikið notuð sem illgresiseyðir til að stjórna illgresi. Vegna þess að nota þarf mismunandi gerðir illgresiseyðis er þörf á að bera kennsl á efnasambönd með nýjum verkunarháttum. Í þessari rannsókn uppgötvuðum við nýtt N-alkoxýpýrról efnasamband, kúmamonamíð, úr Streptomyces werraensis MK493-CF1 og komum á fót öllu myndunarferlinu. Með líffræðilegum virkniprófum uppgötvuðum við að urs-mónóamínsýra er tilbúið milliefni urs-mónómíðs og hugsanlega ...vaxtarhemill plantnaAð auki höfum við þróað ýmsar afleiður úrbenónsýru, þar á meðal úrbenýloxýafleiðuna (UDA), sem hefur mikla illgresiseyðandi virkni án þess að hafa neikvæð áhrif á vöxt HeLa-frumna. Við komumst einnig að því að afleiður úrmótónsýru raska örpíplum plantna; að auki hefur KAND áhrif á aktínþræði og veldur frumudauða; Þessi fjölþættu áhrif eru frábrugðin þeim sem þekktir örpípluhemlar hafa og benda til nýs verkunarháttar úrsónsýru, sem er mikilvægur kostur við þróun nýrra illgresiseyða.
Uppgötvun og hagnýt notkun gagnlegra náttúruafurða og afleiða þeirra er leið til að bæta lífsgæði manna. Aukaefni sem örverur, plöntur og skordýr framleiða hafa leitt til mikilla framfara í læknisfræði og landbúnaði. Mörg sýklalyf og lyf gegn hvítblæði hafa verið þróuð úr náttúruafurðum. Að auki eru ýmsar gerðir afskordýraeitur, sveppalyf og illgresiseyðir eru unnin úr þessum náttúruafurðum til notkunar í landbúnaði. Sérstaklega eru illgresiseyðir mikilvæg verkfæri til að auka uppskeru í nútíma landbúnaði og ýmsar gerðir efnasambanda eru þegar notaðar í viðskiptalegum tilgangi. Nokkrir frumuferlar í plöntum, svo sem ljóstillífun, amínósýruumbrot, frumuveggjamyndun, stjórnun á mítósu, plöntuhormónaboðagjöf eða próteinmyndun, eru talin dæmigerð skotmörk illgresiseyðis. Efnasambönd sem hamla örpíplustarfsemi eru algengur flokkur illgresiseyðis sem hafa áhrif á vöxt plantna með því að hafa áhrif á mítósustjórnun2.
Örpíplur eru þættir frumugrindarinnar og eru víða varðveittir í heilkjörnungafrumum. Túbúlín tvíliðan samanstendur af α-túbúlíni og β-túbúlíni og mynda línulegar örpíplufrumþræðir, þar sem 13 frumþræðir mynda sívalningslaga byggingu. Örpíplur gegna mörgum hlutverkum í plöntufrumum, þar á meðal að ákvarða lögun frumna, frumuskiptingu og innanfrumuflutning3,4. Plöntufrumur innihalda örpíplur undir millifasa himnunni og þessir svokölluðu barkarörpíplur eru taldir stjórna skipulagi sellulósaörþráða með því að stjórna sellulósasyntasa fléttum4,5. Barkarörpíplur rótarhúðfrumna, sem eru til staðar á svæðinu þar sem rótaroddurinn lengist hratt, eru staðsettir lárétt og sellulósaörþræðir fylgja þessum örpíplum og takmarka stefnu frumufjölgunar og stuðla þannig að ósamhverfu frumulengingu. Þess vegna er virkni örpípla nátengd formgerð plantna. Amínósýruskiptingar í genum sem kóða fyrir túbúlín valda skekkju í örpíplufylkingum í heilaberki og vinstri eða hægri hliðarvexti í Arabidopsis 6,7. Á sama hátt geta stökkbreytingar í örpíplutengdum próteinum sem stjórna örpípluhreyfingum einnig leitt til brenglaðs rótarvaxtar8,9,10,11,12,13. Að auki veldur meðferð með örpíplu-röskunarlyfjum eins og dísópýramíði, einnig þekkt sem pretilaklór, einnig vinstri hliðar skáhallt rótarvöxt14. Þessi gögn benda til þess að nákvæm stjórnun á örpíplustarfsemi sé mikilvæg til að ákvarða vaxtarstefnu plantna.
Ýmsar gerðir örpípluhemla hafa verið uppgötvaðar og þessi lyf hafa lagt verulegan þátt í rannsóknum á frumugrind, sem og í landbúnaði og læknisfræði2. Einkum geta oryzalín, dínítróanilín efnasambönd, dísópýramíð, bensamíð-skyld efnasambönd og hliðstæður þeirra hamlað starfsemi örpípla og þar með hamlað vexti plantna. Þess vegna eru þau mikið notuð sem illgresiseyðir. Hins vegar, þar sem örpíplar eru mikilvægur þáttur í plöntu- og dýrafrumum, eru flestir örpípluhemlar frumudrepandi fyrir báðar frumugerðirnar. Þess vegna, þrátt fyrir viðurkennda notagildi þeirra sem illgresiseyðir, er takmarkaður fjöldi örpípluhemjandi lyfja notaður í hagnýtum tilgangi.
Streptomyces er ættkvísl af ættinni Streptomyces, sem inniheldur loftháðar, gram-jákvæðar, þráðlaga bakteríur og er víða þekkt fyrir hæfni sína til að framleiða fjölbreytt úrval af annars stigs umbrotsefnum. Þess vegna er hún talin ein mikilvægasta uppspretta nýrra líffræðilega virkra náttúruafurða. Í þessari rannsókn uppgötvuðum við nýtt efnasamband sem kallast kúmamonamíð, sem var einangrað úr Streptomyces werraensis MK493-CF1 og S. werraensis ISP 5486. Með því að nota litrófsgreiningu og heildar litrófsgreiningu var uppbygging kúmamonamíðs einkennd og einstakt N-alkoxýpýrrólgrind þess ákvörðuð. Úrsmónsýra, tilbúið milliefni úrsmónamíðs og afleiða þess, reyndist hamla vexti og spírun vinsælu fyrirmyndarplöntunnar Arabidopsis thaliana. Í rannsókn á tengslum byggingar og virkni komumst við að því að efnasamband með C9 breytt í úrsónsýru, kallað nonýloxýafleiða úrsónsýru (KAND), eykur verulega hamlandi áhrif á vöxt og spírun. Athyglisvert er að nýuppgötvaði vaxtarhemillinn hafði einnig áhrif á vöxt tóbaks og lifrarblóma og var ekki frumudrepandi fyrir bakteríur eða HeLa frumur. Þar að auki valda sumar afleiður úrmótónsýru afmyndun rótarsvipgerð, sem gefur til kynna að þessar afleiður hafi bein eða óbein áhrif á örpíplur. Í samræmi við þessa hugmynd benda athuganir okkar á örpíplum, sem eru merktar annaðhvort ónæmisvefjafræðilega eða með flúrljómandi próteinum, til þess að KAND meðferð afpolymeriserar örpíplur. Að auki raskar meðferð með afleiðum úr kúmamótónsýru aktín örþráðum. Þannig höfum við uppgötvað nýjan vaxtarhemil sem hefur einstaka verkunarháttur sem felur í sér eyðingu frumugrindarinnar.
Stofninn MK493-CF1 var einangraður úr jarðvegi í Shinagawa-ku í Tókýó. Stofninn MK493-CF1 myndaði vel greinótt bandvefsþráða. Hlutaröð 16S ríbósóm RNA gensins (1422 bp) var ákvörðuð. Þessi stofn er mjög líkur S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: dæmigerður stofn, 99,93%). Byggt á þessari niðurstöðu var ákvarðað að þessi stofn væri náskyldur gerðarstofni S. werraensis. Þess vegna nefndum við þennan stofn bráðabirgðalega S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T framleiðir einnig sömu lífvirku efnasamböndin. Þar sem litlar rannsóknir voru gerðar á því að fá náttúrulegar vörur úr þessari örveru, voru frekari efnafræðilegar rannsóknir gerðar. Eftir ræktun S. werraensis MK493-CF1 á byggmiðli með föstu gerjun við 30°C í 14 daga, var miðillinn einangraður með 50% EtOH. 60 ml af sýninu voru þurrkaðir til að fá 59,5 mg af hráefnisútdrætti. Hráefnisútdrátturinn var settur í öfuga fasa háþrýstivökvaskiljun (HPLC) til að fá N-metoxý-1H-pýrról-2-karboxamíð (1, nefnt kúmamonamíð, 36,0 mg). Heildarmagn 1 er um það bil 60% af hráefnisútdrættinum. Þess vegna ákváðum við að rannsaka eiginleika kúmamótóamíðs 1 ítarlega.
Kúmamonamíð 1 er hvítt, ókristallað duft og massagreining með mikilli upplausn (HRESIMS) staðfestir C6H8N2O2 (Mynd 1). C2-skipt pýrrólbrot þessa efnasambands einkennist af δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH í 1H NMR litrófi: 4,5 Hz, H-5) og δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), og 13C NMR litrófið sýnir fjögur sp2 kolefnisatóm. Tilvist amíðhóps í C2 stöðunni var metin með HMBC fylgni frá C-3 róteindinni við amíðkarbónýl kolefnið við δC 161,1. Að auki benda 1H og 13C NMR tindar við δH 4,10 (3H, S) og δC 68,3 til nærveru N-metoxýhópa í sameindinni. Þó að rétt staðsetning metoxýhópsins hefði ekki enn verið ákvörðuð með litrófsgreiningu eins og aukinni mismunarlitrófsgreiningu og kjarna-Overhauser skammstöfuninni (NOEDF), varð N-metoxý-1H-pýrról-2-karboxamíð fyrsta hugsanlega efnasambandið.
Til að ákvarða rétta uppbyggingu 1 var framkvæmd heildarmyndun (Mynd 2a). Meðhöndlun á verslunarfáanlegu 2-amínópyridíni 2 með m-CPBA leiddi til samsvarandi N-oxíðs 3 í megindlega ávöxtun. Eftir 2-amínóazíðun 2 var hringþéttingarviðbrögðin sem Abramovich lýsti framkvæmd í benseni við 90°C til að fá æskilegt 1-hýdroxý-1H-pýrról-2-karbónítríl 5 í grömmum. Hraði 60% (tvö stig). 15,16. Metýlering og vatnsrof á 4 gaf síðan 1-metoxý-1H-pýrról-2-karboxýlsýru (kölluð „kúmótónsýra“, 6) í góðri ávöxtun (70%, tvö skref). Að lokum gaf amíðering með sýruklóríð milliefni 6 með því að nota vatnskenndan ammóníak Kumamoto amíð 1 í 98% ávöxtun. Öll litrófsgögn um myndaða 1 voru svipuð og einangraðs 1, þannig að uppbygging 1 var ákvörðuð;
Almenn myndun og greining á líffræðilegri virkni úrbenamíðs og úrbensýru. (a) Heildarmyndun Kumamoto-amíðs. (b) Sjö daga gamlar villtar Arabidopsis Columbia (Col) plöntur voru ræktaðar á Murashige og Skoog (MS) plötum sem innihéldu kúmamonamíð 6 eða kúmamonamíð 1 í tilgreindum styrk. Kvarðastika = 1 cm.
Fyrst metum við líffræðilega virkni úrbenamíðs og milliefna þess til að stjórna vexti plantna. Við bættum mismunandi styrk af úrsmónamíði 1 eða úrsmónsýru 6 við MS agarmiðil og ræktuðum Arabidopsis thaliana plöntur á þessum miðli. Þessar prófanir sýndu að hár styrkur (500 μM) af 6 hamlaði rótarvexti (Mynd 2b). Næst bjuggum við til ýmsar afleiður með því að skipta út N1 stöðu 6 og framkvæmdum rannsóknir á tengslum byggingar og virkni á þeim (smíðaferlið við hliðstæðumyndun er lýst í viðbótarefninu (SI)). Arabidopsis plöntur voru ræktaðar á miðli sem innihélt 50 μM af úrsónsýruafleiðum og rótarlengd var mæld eins og sést á myndinni. Eins og sést á myndum 3a, b og S1 hafa kúmamósýrur mismunandi lengdir af línulegum alkoxýkeðjum (9, 10, 11, 12 og 13) eða stórar alkoxýkeðjur (15, 16 og 17) á N1 stöðu. Afleiðurnar sýndu marktæka hömlun á rótarvexti. Að auki komumst við að því að notkun 200 μM af 10, 11 eða 17 hamlaði spírun (Myndir 3c og S2).
Rannsókn á tengslum byggingar og virkni Kumamoto amíðs og skyldra efnasambanda. (a) Byggingar- og myndunarkerfi hliðstæðna. (b) Magnbundin ákvörðun á rótarlengd 7 daga gamalla plöntu sem ræktaðar voru á MS ræktunarmiðli með eða án 50 μM kúmamonamíð afleiða. Stjörnur gefa til kynna marktækan mun við sýndarmeðferð (t-próf, p< 0,05). n>18. Gögn eru sýnd sem meðaltal ± staðalfrávik. nt þýðir „ekki prófað“ þar sem meira en 50% fræjanna spíruðu ekki. (c) Magnbundin ákvörðun á spírunarhraða meðhöndluðra fræja sem voru ræktuð í 7 daga í MS-miðli með eða án 200 μM kúmamonamíðs og skyldra efnasambanda. Stjörnur gefa til kynna marktækan mun á sýndarmeðferð (kí-kvaðrat próf). n=96.
Athyglisvert er að viðbót alkýlhliðarkeðja sem eru lengri en C9 minnkaði hamlandi virknina, sem bendir til þess að efnasambönd sem tengjast kúmamótósýru þurfi hliðarkeðjur af ákveðinni stærð til að sýna líffræðilega virkni sína.
Þar sem greining á tengslum byggingar og virkni sýndi að C9 var breytt í úrsónsýru og að nonýloxýafleiðan úrsónsýru (hér eftir nefnt KAND 11) var áhrifaríkasta vaxtarhemillinn fyrir plöntur, framkvæmdum við ítarlegri greiningu á KAND 11. Meðferð Arabidopsis með 50 μM af KAND 11 kom næstum alveg í veg fyrir spírun, en lægri styrkur (40, 30, 20 eða 10 μM) af KAND 11 hamlaði rótarvexti á skammtaháðan hátt (Mynd 4a, b). Til að prófa hvort KAND 11 hefur áhrif á lífvænleika rótarfrumna, skoðuðum við rótarfrumna litaða með própídíumjoðidi (PI) og mældum stærð flatarmálsfrumna. Stærð frumuskiptingarsvæðis ungplöntur sem ræktaðar voru á ræktunarmiðli sem innihélt 25 μM af KAND-11 var 151,1 ± 32,5 μm, en stærð frumuskiptingarsvæðis ungplöntur sem ræktaðar voru á samanburðarræktunarmiðli sem innihélt DMSO var 264,7 ± 30,8 μm (Mynd 4c, d), sem bendir til þess að KAND-11 endurheimtir frumuvirkni. Rótarfrumuskiptingarsvæði. Í samræmi við þetta minnkaði meðferð með KAND 11 magn frumuskiptingarmerkisins CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS merkis í rótarfrumuskiptingarsvæðinu (Mynd 4e) 17. Þessar niðurstöður benda til þess að KAND 11 hamli rótarvexti með því að draga úr frumufjölgunarvirkni.
Greining á hömlunaráhrifum urbenónsýruafleiða (urbenýloxýafleiða) á vöxt. (a) 7 daga gamlar villtar Col-plöntur ræktaðar á MS-plötum með tilgreindum styrk KAND 11. Kvarðastika = 1 cm. (b) Magnbundin ákvörðun á rótarlengd. Stafir gefa til kynna marktækan mun (Tukey HSD próf, bls.< 0,05). n>16. Gögn eru sýnd sem meðaltal ± staðalfrávik. (c) Smásjárskoðun á villtum Col rótum af própíumjoðíði, ræktuðum á MS plötum með eða án 25 μM KAND 11. Hvítir sviga gefa til kynna rótarmeristem. Kvarðastika = 100 µm. (d) Magnbundin ákvörðun á stærð rótarmeristems (n = 10 til 11). Tölfræðilegur munur var ákvarðaður með t-prófi (p< 0,05). Súlurnar tákna meðalstærð meristemsins. (e) Mismunadreifingarskuggagreining (DIC) á rótarmeristemi sem inniheldur CDKB2 smygildið; 1pro: CDKB2; 1-GUS litað og litað á 5 daga gömlum plöntum sem ræktaðar voru á MS plötum með eða án 25 µM KAND prófunar.
Plöntueituráhrif KAND 11 voru frekar prófuð með annarri tvíkímblöðungi, tóbaki (Nicotiana tabacum), og helstu fyrirmyndarlífveru landplöntu, lifrarjurt (Marchantia polymorpha). Eins og í tilviki Arabidopsis, framleiddu tóbaks SR-1 plöntur sem ræktaðar voru á ræktunarmiðli sem innihélt 25 μM KAND 11 styttri rætur (Mynd 5a). Að auki spíruðu 40 af 48 fræjum á plötum sem innihéldu 200 μM KAND 11, en öll 48 fræin spíruðu á ræktunarmiðli sem hafði verið meðhöndlaður, sem bendir til þess að hærri styrkur KAND væri marktækur (p< 0,05; kí-próf -kvaðrat) hamlaði spírun tóbaks. (Mynd 5b). Að auki var styrkur KAND 11 sem hamlaði bakteríuvexti í lifrarjurt svipaður og virkur styrkur í Arabidopsis (Mynd 5c). Þessar niðurstöður benda til þess að KAND 11 geti hamlað vexti ýmissa plantna. Við rannsökuðum síðan möguleg frumueituráhrif bjarnarmónóamíð-tengdra efnasambanda í öðrum lífverum, þ.e. mönnum HeLa frumum og Escherichia coli stofni DH5α, sem fulltrúar hærri dýra- og bakteríufrumu, talið í sömu röð. Í röð frumufrumufjölgunarprófa komumst við að því að kúmamonamíð 1, kúmamonamíðsýra 6 og KAND 11 höfðu ekki áhrif á vöxt HeLa eða E. coli frumna við styrk 100 μM (Mynd 5d,e).
Vaxtarhömlun KAND 11 í lífverum sem ekki eru af Arabidopsis-ætt. (a) Tveggja vikna gamlar villtar SR-1 tóbaksplöntur voru ræktaðar á lóðréttum MS-plötum sem innihéldu 25 μM KAND 11. (b) Tveggja vikna gamlar villtar SR-1 tóbaksplöntur voru ræktaðar á láréttum MS-plötum sem innihéldu 200 μM KAND 11. (c) Tveggja vikna gamlar villtar Tak-1 lifrarblómknappar ræktaðir á Gamborg B5 plötum með tilgreindum styrk af KAND 11. Rauðar örvar gefa til kynna gró sem hættu að vaxa innan tveggja vikna ræktunartímabilsins. (d) Frumufrumufjölgunarpróf á HeLa frumum. Fjöldi lífvænlegra frumna var mældur með föstum millibilum með því að nota frumutalningarbúnað 8 (Dojindo). Sem samanburðarpróf voru HeLa frumur meðhöndlaðar með 5 μg/ml aktínómýsín D (Act D), sem hindrar RNA pólýmerasa umritun og veldur frumudauða. Greiningar voru framkvæmdar í þríriti. (e) E. coli frumufjölgunarpróf. Vöxtur E. coli var greindur með því að mæla OD600. Sem samanburðarhópur voru frumur meðhöndlaðar með 50 μg/ml af ampisillíni (Amp), sem hamlar frumuveggsmyndun baktería. Greiningar voru framkvæmdar í þríriti.
Til að greina verkunarháttur frumudrepandi áhrifa af völdum úramíð-skyldra efnasambanda, endurgreindum við úrbensýruafleiður með miðlungi hömlunaráhrif, eins og sést á myndinni. Eins og sést á myndum 2b og 6a, framleiddu plöntur sem ræktaðar voru á agarplötum sem innihéldu háan styrk (200 μM) af úrmótónsýru 6 styttri og vinstri-sveigðar rætur (θ = – 23,7 ± 6,1), en hjá plöntum sem ræktaðar voru á samanburðarmiðlinum framleiddu plönturnar næstum beinar rætur (θ = – 3,8 ± 7,1). Þessi einkennandi skávöxtur er þekktur fyrir að stafa af truflun á örpíplum í heilaberki14,18. Í samræmi við þessa niðurstöðu ollu örpípluóstöðugleikalyfin dísópýramíð og oryzalín svipaðri rótarhalla við vaxtarskilyrði okkar (myndir 2b og 6a). Á sama tíma prófuðum við úrmótónsýruafleiður og völdum nokkrar þeirra sem, við ákveðinn styrk, ollu skárótarvexti. Efnasamböndin 8, 9 og 15 breyttu stefnu rótarvaxtar við 75 μM, 50 μM og 40 μM, talið í sömu röð, sem bendir til þess að þessi efnasambönd geti á áhrifaríkan hátt gert örpíplur óstöðuga (Mynd 2b, 6a). Við prófuðum einnig öflugasta úrsólsýruafleiðuna, KAND 11, við lægri styrk (15 μM) og komumst að því að notkun KAND 11 hamlaði rótarvexti og að stefna rótarvaxtar var ójöfn, þó að hún hallaði til vinstri (Mynd C3). Þar sem hærri styrkur lyfja sem gera örpíplur óstöðuga hamla stundum plöntuvexti frekar en að valda rótarhalla, mátum við síðan möguleikann á að KAND 11 hafi áhrif á örpíplur með því að fylgjast með berkiörpíplum í húðfrumum rótar. Ónæmisvefjaefnafræði með því að nota mótefni gegn β-túbúlíni í húðfrumum fræplönturóta sem meðhöndlaðar voru með 25 μM KAND 11 sýndi að næstum öll berkiörpíplur í húðfrumum í lengingarsvæðinu hurfu (Mynd 6b). Þessar niðurstöður benda til þess að kúmamótonsýra og afleiður hennar virki beint eða óbeint á örpíplur til að raska þeim og að þessi efnasambönd séu nýir örpíplnahemlar.
Úrsónsýra og afleiður hennar breyta örpíplum í heilaberki Arabidopsis thaliana. (a) Rótarhalla mældur í viðurvist ýmissa afleiða úrmótónsýru við tilgreindan styrk. Áhrif tveggja efnasambanda sem vitað er að hamla örpíplum: dísópýramíðs og órýsalíns voru einnig greind. Innskot sýnir staðalinn sem notaður er til að mæla vaxtarhorn rótar. Stjörnur gefa til kynna marktækan mun við sýndarmeðferð (t-próf, p< 0,05). n>19. Kvarðastika = 1 cm. (b) Barkarörpípur í húðfrumum í lengingarsvæðinu. Örpípur í villtum rótum Arabidopsis Col sem ræktaðar voru á MS plötum með eða án 25 μM KAND 11 voru sýndar með ónæmisvefjafræðilegri litun með því að nota β-túbúlín frummótefni og Alexa Fluor-tengd aukamótefni. Kvarðastika = 10 µm. (c) Mítósubygging örpípla í rótarmeristeminu. Örpípur voru sýndar með ónæmisvefjafræðilegri litun. Mítósubyggingar, þar á meðal prófasasvæði, spólur og sprotar, voru taldar úr confocal myndum. Örvar gefa til kynna mítósubyggingarörpípla. Stjörnur gefa til kynna marktækan mun við sýndarmeðferð (t próf, p< 0,05). n>9. Kvarðastika = 50 µm.
Þó að Ursa geti raskað starfsemi örpípla er búist við að verkunarháttur þess sé frábrugðinn dæmigerðum örpíplaafpólýmerunarefnum. Til dæmis valda hærri styrkur örpíplaafpólýmerunarefna eins og dísópýramíðs og oryzalíns anisótrópískri útþenslu húðfrumna, en KAND 11 gerir það ekki. Að auki leiddi samhliða notkun KAND 11 og dísópýramíðs til tvísópýramíð-örvaðrar rótarvaxtarsvörunar og KAND 11-örvuð vaxtarhömlun sást (Mynd S4). Við greindum einnig svörun ofurnæmu dísópýramíð 1-1 (phs1-1) stökkbreytingarinnar við KAND 11. phs1-1 hefur ekki dæmigerða túbúlín kínasa punktstökkbreytingu og framleiðir styttri rætur þegar hún er meðhöndluð með dísópýramíði9,20. phs1-1 stökkbreyttar plöntur sem ræktaðar voru á agarmiðli sem innihélt KAND 11 höfðu styttri rætur svipaðar þeim sem ræktaðar voru á dísópýramíði (mynd S5).
Að auki sáum við mítósu örpíplabyggingu, svo sem prófasasvæði, spólur og sprotaplöntur, í rótarþekju ungplöntu sem meðhöndlaðar voru með KAND 11. Í samræmi við athuganir fyrir CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS sást marktæk fækkun mítósu örpípla (Mynd .6c).
Til að lýsa frumueituráhrifum KAND 11 við undirfrumuupplausn meðhöndluðum við BY-2 sviflausnarfrumur úr tóbaki með KAND 11 og fylgdumst með svörun þeirra. Við bættum fyrst KAND 11 við BY-2 frumur sem tjá TagRFP-TUA6, sem merkir örpíplur með flúrljómun, til að meta áhrif KAND 11 á örpíplur í heilaberki. Þéttleiki örpípla í heilaberki var metinn með myndgreiningu, sem magngreindi hlutfall pixla í frumugrind meðal pixla í frumuvökvanum. Niðurstöður prófunarinnar sýndu að eftir meðferð með 50 μM eða 100 μM af KAND 11 í 1 klukkustund minnkaði þéttleikinn verulega í 0,94 ± 0,74% eða 0,23 ± 0,28%, talið í sömu röð, en þéttleiki frumna sem meðhöndlaðar voru með DMSO nam 1,61 ± 0,34% (Mynd 7a). Þessar niðurstöður eru í samræmi við athugunina í Arabidopsis að meðferð með KAND 11 veldur afpolymeringu örpípla í heilaberki (Mynd 6b). Við skoðuðum einnig BY-2 línuna með GFP-ABD-merktum aktínþráðum eftir meðferð með sama styrk af KAND 11 og komumst að því að KAND 11 meðferð raskaði aktínþráðunum. Meðferð með 50 μM eða 100 μM KAND 11 í 1 klst. minnkaði þéttleika aktínþráða verulega niður í 1,20 ± 0,62% eða 0,61 ± 0,26%, talið í sömu röð, en þéttleikinn í DMSO-meðhöndluðum frumum var 1,69 ± 0,51% (Mynd 2). 7b). Þessar niðurstöður stangast á við áhrif própýsamíðs, sem hefur ekki áhrif á aktínþræði, og latrínkúlíns B, aktínafpolymeriserandi efnis sem hefur ekki áhrif á örpípla (SI mynd S6). Að auki hafði meðferð með kúmamonamíði 1, kúmamonamíðsýru 6 eða KAND 11 ekki áhrif á örpípla í HeLa frumum (SI mynd S7). Þannig er talið að verkunarháttur KAND 11 sé frábrugðinn verkunarháttum þekktra frumugrindarröskunarefna. Þar að auki leiddi smásjárathugun okkar á BY-2 frumum sem meðhöndlaðar voru með KAND 11 í ljós upphaf frumudauða meðan á KAND 11 meðferð stóð og sýndi að hlutfall dauðra frumna, litaðra með Evans-bláum lit, jókst ekki marktækt eftir 30 mínútna meðferð með KAND 11, en eftir 90 mínútna meðferð með 50 μM eða 100 μM KAND jókst fjöldi dauðra frumna í 43,7% eða 80,1%, talið í sömu röð (Mynd 7c). Samanlagt benda þessi gögn til þess að nýja úrsólsýruafleiðan KAND 11 sé plöntusértækur frumugrindarhemill með áður óþekktum verkunarháttum.
KAND hefur áhrif á örpíplur í heilaberki, aktínþræði og lífvænleika BY-2 frumna í tóbaki. (a) Sýn á örpíplum í heilaberki í BY-2 frumum í viðurvist TagRFP-TUA6. BY-2 frumur sem meðhöndlaðar voru með KAND 11 (50 μM eða 100 μM) eða DMSO voru skoðaðar með confocal smásjá. Þéttleiki örpíplna í heilaberki var reiknaður út frá smásjármyndum af 25 óháðum frumum. Stafir gefa til kynna marktækan mun (Tukey HSD próf, bls.< 0,05). Kvarðastika = 10 µm. (b) Berkiaktínþræðir í BY-2 frumum sýndir í viðurvist GFP-ABD2. BY-2 frumur meðhöndlaðar með KAND 11 (50 µM eða 100 µM) eða DMSO voru skoðaðar með confocal smásjá. Þéttleiki berkiaktínþráða var reiknaður út frá smásjármyndum af 25 óháðum frumum. Stafir gefa til kynna marktækan mun (Tukey HSD próf, p< 0,05). Kvarðastika = 10 µm. (c) Athugun á dauðum BY-2 frumum með Evans blári litun. BY-2 frumur meðhöndlaðar með KAND 11 (50 µM eða 100 µM) eða DMSO voru skoðaðar með björtu smásjársjá. n=3. Kvarðastika = 100 µm.
Uppgötvun og notkun nýrra náttúruafurða hefur leitt til verulegra framfara á ýmsum sviðum mannlífsins, þar á meðal læknisfræði og landbúnaðar. Sögulegar rannsóknir hafa verið gerðar til að afla gagnlegra efnasambanda úr náttúruauðlindum. Sérstaklega eru aktínómýsetar þekktar fyrir að vera gagnlegar sem sníkjudýraeyðandi sýklalyf gegn þráðormum vegna getu þeirra til að framleiða ýmis afleidd umbrotsefni eins og avermektín, aðalefnasambandið ívermektíns og bleómýsíns og afleiða þess, sem notuð eru í læknisfræði sem krabbameinslyf21,22. Á sama hátt hafa fjölbreytt illgresiseyðandi efnasambönd fundist úr aktínómýsetum, og sum þeirra eru þegar notuð í atvinnuskyni1,23. Þess vegna er greining á umbrotsefnum aktínómýseta til að einangra náttúruafurðir með æskilegri líffræðilegri virkni talin áhrifarík stefna. Í þessari rannsókn uppgötvuðum við nýtt efnasamband, kúmamonamíð, úr S. werraensis og mynduðum það með góðum árangri. Úrsónsýra er tilbúið milliefni úrbenamíðs og afleiða þess. Það getur valdið einkennandi rótarkrulningi, sýnt miðlungs til sterka illgresiseyðandi virkni og beint eða óbeint skemmt örpíplur plantna. Hins vegar getur verkunarháttur úrmótónsýru verið frábrugðinn verkunarháttur núverandi örpípluhemla, þar sem KAND 11 truflar einnig aktínþræði og veldur frumudauða, sem bendir til stjórnunarháttar þar sem úrmótónsýra og afleiður hennar hafa áhrif á fjölbreytt úrval frumugrindarbygginga.
Nánari greining á úrbenónsýru mun hjálpa til við að skilja betur verkunarháttur hennar. Næsta markmið er sérstaklega að meta getu úrsonsýru til að bindast afoxuðum örpíplum til að ákvarða hvort úrsonsýra og afleiður hennar virka beint á örpíplur og afpolymera þær, eða hvort verkun þeirra leiðir til óstöðugleika örpípla. Þar að auki, ef örpíplur eru ekki beint skotmark, mun það að bera kennsl á verkunarstað og sameindamarkmið úrsonsýru á plöntufrumum hjálpa til við að skilja betur eiginleika skyldra efnasambanda og mögulegar leiðir til að bæta illgresiseyðandi virkni. Lífvirknipróf okkar leiddi í ljós einstaka frumueyðandi getu úrsonsýru á vöxt plantna eins og Arabidopsis thaliana, tóbaks og lifrarmosa, en hvorki E. coli né HeLa frumur urðu fyrir áhrifum. Lítil eða engin eituráhrif á dýrafrumur eru kostur af úrsonsýruafleiðum ef þær eru þróaðar sem illgresiseyðir til notkunar á opnum landbúnaðarsvæðum. Reyndar, þar sem örpíplur eru algengar byggingar í heilkjörnungum, er sértæk hömlun þeirra í plöntum lykilkrafa fyrir illgresiseyði. Til dæmis er própýsamíð, örpípluafpólýmerandi efni sem binst beint við túbúlín og hindrar fjölliðun, notað sem illgresiseyðir vegna lítillar eituráhrifa þess á dýrafrumur24. Ólíkt dísópýramíði hafa skyld bensamíð mismunandi sértækni. Auk örpípla í plöntum hamlar RH-4032 eða bensoxamíð einnig örpíplum í dýrafrumum eða eggfrumum, og zalílamíð er notað sem sveppalyf vegna lítillar eituráhrifa þess á plöntur25,26,27. Nýuppgötvaða björninn og afleiður hans sýna sértæka frumueituráhrif gegn plöntum, en það er vert að taka fram að frekari breytingar geta breytt sértækni þeirra og hugsanlega veitt frekari afleiður til að stjórna sjúkdómsvaldandi sveppum eða eggfrumum.
Einstakir eiginleikar úrbenónsýru og afleiða hennar eru gagnlegir fyrir þróun þeirra sem illgresiseyði og notkun sem rannsóknartól. Mikilvægi frumugrindarinnar í stjórnun lögun plantnafruma er almennt viðurkennt. Fyrri rannsóknir hafa sýnt að plöntur hafa þróað flóknar aðferðir við skipulagningu örpípla í heilaberki með því að stjórna örpíplavirkni til að stjórna formgerð á réttan hátt. Fjölmargar sameinda sem bera ábyrgð á stjórnun örpíplavirkni hafa verið greindar og tengdar rannsóknir eru enn í gangi3,4,28. Núverandi skilningur okkar á örpíplavirkni í plöntufrumum útskýrir ekki að fullu aðferðir skipulagningar örpípla í heilaberki. Til dæmis, þó að bæði dísópýramíð og órýsalín geti afpolymerað örpípla, veldur dísópýramíð alvarlegri rótaraflögun en órýsalín hefur tiltölulega væg áhrif. Ennfremur valda stökkbreytingar í túbúlíni, sem stöðugar örpípla, einnig hægri snúningi í rótum, en paklítaxel, sem einnig stöðugar örpíplavirkni, gerir það ekki. Þess vegna ætti rannsókn og greining á sameindamarkmiðum úrsólsýru að veita nýja innsýn í stjórnun örpípla í heilaberki plantna. Á sama hátt munu framtíðar samanburðir á efnum sem eru áhrifarík við að stuðla að brengluðum vexti, svo sem dísópýramíði, og minna áhrifaríkum efnum, svo sem órýzalíni eða kúmamótórsýru, gefa vísbendingar um hvernig brenglaður vöxtur á sér stað.
Hins vegar eru varnartengdar endurraðanir á frumugrind annar möguleiki á að skýra frumueituráhrif úrsónsýru. Sýking sýkla eða innleiðing á framkallara í plöntufrumur veldur stundum eyðileggingu frumugrindarinnar og síðari frumudauða29. Til dæmis hefur verið greint frá því að kryptoxantín, sem unnið er úr oomycete, raski örpíplum og aktínþráðum áður en tóbaksfrumur deyja, svipað og gerist við KAND meðferð30,31. Líkt og varnarviðbrögð og frumuviðbrögð sem úrsónsýru veldur leiddi okkur til þeirrar tilgátu að þau kveiki á algengum frumuferlum, þó að hraðari og sterkari áhrif úrsónsýru en kryptoxantíns séu augljós. Hins vegar hafa rannsóknir sýnt að röskun á aktínþráðum stuðlar að sjálfsprottnum frumudauða, sem fylgir ekki alltaf röskun á örpíplum29. Að auki er óljóst hvort annað hvort sýkillinn eða framkallarinn veldur brengluðum rótarvexti, eins og afleiður úrsónsýru gera. Þannig er sameindaþekking sem tengir varnarviðbrögð og frumugrindina aðlaðandi vandamál sem þarf að taka á. Með því að nýta sér nærveru efnasambanda með lágan mólþunga sem tengjast úrsónsýru, sem og fjölbreyttra afleiða með mismunandi virkni, gætu þau veitt tækifæri til að miða á óþekktar frumuferla.
Samanlagt mun uppgötvun og notkun nýrra efnasambanda sem stjórna virkni örpípla veita öflugar aðferðir til að takast á við þá flóknu sameindaferla sem liggja að baki ákvörðun um lögun plantnafrumna. Í þessu samhengi gæti nýlega þróaða efnasambandið úrmótónsýra, sem hefur áhrif á örpípla og aktínþræði og veldur frumudauða, veitt tækifæri til að greina tengslin milli stjórnun örpípla og þessara annarra ferla. Þannig mun efna- og líffræðileg greining með úrbenónsýru hjálpa okkur að skilja þá sameindastjórnunarferla sem stjórna frumugrind plantna.
Sáð er S. werraensis MK493-CF1 í 500 ml Erlenmeyer-flösku með batter sem inniheldur 110 ml af sáðmiðli sem samanstendur af 2% (w/v) galaktósa, 2% (w/v) kjarnapasta, 1% (w/v) Bacto-samsetningu. N-sojasýru (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) maísþykkni (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 og 0,2% CaCO3 í afjónuðu vatni. (pH 7,4 fyrir sótthreinsun). Fræræktunin var ræktuð á snúningshristara (180 snúningar á mínútu) við 27°C í 2 daga. Ræktun fór fram með gerjun í föstu formi. Fræræktunin (7 ml) var flutt í 500 ml K-1 flösku sem innihélt 40 g af framleiðslumiðli sem samanstóð af 15 g af pressuðu byggi (MUSO Co., Ltd., Japan) og 25 g af afjónuðu vatni (pH ekki stillt fyrir sótthreinsun). Gerjun fór fram við 30°C í myrkri í 14 daga. Gerjunarefnið var dregið út með 40 ml af EtOH á flösku og skilvind (1500 g, 4°C, 10 mín.). Yfirborðsvökvinn (60 ml) var dreginn út með blöndu af 10% MeOH/EtOAc. Lífræna lagið var gufað upp við lækkaðan þrýsting til að fá leif (59,5 mg), sem var háð HPLC með stigulsútskiljun (0–10 mínútur: 90%) á öfugum fasa súlu (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, innra þvermál 10 mm × lengd 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 mínútur: 90% H2O/CH3CN í 70% H2O/CH3CN (stigull), 35–45 mínútur: 90% H2O/EtOH, 45–155 mínútur: 90% H2O/EtOH í 100% EtOH (stigull (stigull), 155–200 mín: 100% EtOH) við rennslishraða 1,5 ml/mín. Kúmamonamíð (1, 36,0 mg) var einangrað sem hvítt, ókristallað duft.
Kúmamótóamíð(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz, 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ reiknað gildi: 141,0659, mældur gildi: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Columbia fræ (Col-0) voru fengin frá Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) með leyfi til rannsóknarnota. Col-0 fræ voru ræktuð og viðhaldið við rannsóknarstofuaðstæður og notuð sem villtar Arabidopsis plöntur. Arabidopsis fræin voru yfirborðssótthreinsuð og ræktuð í hálfstyrkri Murashige og Skoog ræktunarmiðli sem innihélt 2% súkrósa (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morfólínó)etansúlfónsýru (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) og 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, við 23°C og stöðugt ljós. Fræ phs1-1 stökkbreytingarinnar voru útveguð af T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Fræ af stofni SR-1 voru útveguð af T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) og notuð sem villtar tóbaksplöntur. Tóbaksfræin voru yfirborðssótthreinsuð og lögð í bleyti í sæfðu vatni í þrjár nætur til að stuðla að spírun, síðan sett í hálfstyrktar lausn sem innihélt 2% súkrósa, 0,05% (w/v) MES og 0,8% gellangúmmí (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige og Skoog miðil) með pH 5,7 og ræktuð við 23°C undir stöðugu ljósi.
T. Kohchi (Kyoto-háskóli) útvegaði Tak-1 stofninn og var notaður sem staðlað tilraunaeining fyrir rannsóknina á lifrarjurtinni. Gemma var fengið úr sótthreinsuðum ræktuðum plöntum og síðan sett á Gamborg B5 miðil (Fujifilm Wako Pure Chemical) sem innihélt 1% súkrósa og 0,3% gellangúmmí og ræktað við 23°C undir stöðugu ljósi.
Tóbaks BY-2 frumur (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) voru útvegaðar af S. Hasezawa (Háskólinn í Tókýó). BY-2 frumur voru þynntar 95-falt í breyttum Linsmeier og Skoog miðli og bætt við vikulega með 2,4-díklórfenoxýediksýru 32. Frumusviflausnin var blönduð á snúningshristara við 130 snúninga á mínútu við 27°C í myrkri. Þvoið frumurnar með 10-földu rúmmáli af ferskum miðli og enduruppleyst í sama miðli. BY-2 erfðabreyttar frumulínur sem tjá stöðugt örpíplumerkið TagRFP-TUA6 eða aktínþráðarmerkið GFP-ABD2 undir blómkálsmosaíkveiru 35S hvata voru myndaðar eins og lýst er 33,34,35. Þessar frumulínur er hægt að viðhalda og samstilla með svipuðum aðferðum og notaðar voru fyrir upprunalegu BY-2 frumulínuna.
HeLa frumur voru ræktaðar í Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) bætt við 10% fósturkúasermi, 1,2 U/ml penisillíni og 1,2 μg/ml streptómýsíni í 37°C hitakúbunartæki með 5% CO2.
Allar tilraunir sem lýst er í þessu handriti voru framkvæmdar í samræmi við japanskar reglur og leiðbeiningar um líföryggi.
Efnasamböndin voru leyst upp í dímetýlsúlfoxíði (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) sem stofnlausnir og þynnt í MS ræktunarmiðli fyrir Arabidopsis og tóbak eða Gamborg B5 ræktunarmiðli fyrir lifrarjurt. Fyrir rótarvaxtarhömlunarprófið voru meira en 10 fræ á plötu sáð á agarræktunarmiðil sem innihélt tilgreind efnasambönd eða DMSO. Fræin voru ræktuð í vaxtarklefa í 7 daga. Spírunarplönturnar voru ljósmyndaðar og lengd rótanna mæld. Fyrir spírunarprófið á Arabidopsis voru 48 fræ á plötu sáð á agarræktunarmiðil sem innihélt 200 μM efnasamband eða DMSO. Arabidopsis fræ voru ræktuð í vaxtarklefa og fjöldi spíraðra spírunarplantna var talinn 7 dögum eftir spírun (dag). Fyrir spírunarprófið á tóbaki voru 24 fræ á plötu sáð á agarræktunarmiðil sem innihélt 200 μM KAND eða DMSO. Tóbaksfræ voru ræktuð í vaxtarklefa og fjöldi spíraðra spírunarplantna var talinn eftir 14 daga. Fyrir vaxtarhömlunarprófið á lifrarjurt voru 9 fósturvísar af hverri plötu settir á agarmiðil sem innihélt tilgreindan styrk af KAND eða DMSO og ræktaðir í vaxtarklefa í 14 daga.
Notið plöntur litaðar með 5 mg/ml própídíumjoðíði (PI) til að sjá skipulag rótarfrumna. PI merki voru skoðuð með flúrljómunarsmásjá með TCS SPE confocal laser skannandi smásjá (Leica Microsystems).
Sjúkdómsfræðileg litun róta með β-glúkúrónídasa (GUS) var framkvæmd samkvæmt aðferðafræði sem Malami og Benfey36 lýstu. Fræplönturnar voru festar í 90% asetoni yfir nótt, litaðar með 0,5 mg/ml af 5-brómó-4-klór-3-indólýl-β-d-glúkúrónsýru í GUS stuðpúða í 1 klukkustund og settar í vatnskennda klóraldehýðlausn (8 g klóralhýdrat, 2 ml vatn og 1 ml glýseról) og skoðaðar með mismunadreifingarsmásjá með Axio Imager M1 smásjá (Carl Zeiss).
Rótarhorn voru mæld á 7 daga gömlum plöntum sem ræktaðar voru á lóðréttum plötum. Mælið horn rótarinnar frá þyngdarkraftsvigrinum eins og lýst er í skrefi 6.
Fyrirkomulag örpípla í heilaberki var skoðað eins og lýst er, með minniháttar breytingum á aðferðafræðinni 37. Mótefni gegn β-túbúlíni (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) og Alexa Fluor 488-tengt músa-IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) voru notuð sem aðal- og aukamótefni í þynningum 1:1000 og 1:100, talið í sömu röð. Flúrljómunarmyndir voru teknar með TCS SPE confocal laserskönnunarsmásjá (Leica Microsystems). Z-stack myndir eru teknar og hámarksstyrkleikavörpun er búin til samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.
HeLa frumufjölgunarpróf var framkvæmt með Cell Counting Kit 8 (Dojindo) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.
Vöxtur E. coli DH5α var greindur með því að mæla frumuþéttleika í ræktun með litrófsmæli við 600 nm (OD600).
Frumugrindarskipulag í erfðabreyttum BY-2 frumum var skoðað með flúrljómunarsmásjá sem var búin CSU-X1 confocal skönnunartæki (Yokogawa) og sCMOS myndavél (Zyla, Andor Technology). Frumugrindarþéttleiki var metinn með myndgreiningu, sem magngreindi hlutfall frumugrindarpixla meðal umfrymispixla í confocal myndum með ImageJ hugbúnaði eins og lýst er38,39.
Til að greina frumudauða í BY-2 frumum var skammtur af frumulausninni ræktaður með 0,05% Evans-bláu í 10 mínútur við stofuhita. Sértæk Evans-blá litun dauðra frumna er háð því að litarefnið sé losað úr lífvænlegum frumum með óskemmdri plasmahimnu40. Litaðar frumur voru skoðaðar með björtsviðssmásjá (BX53, Olympus).
HeLa frumur voru ræktaðar í DMEM bætt við 10% FBS í rakastillandi ræktunarofni við 37°C og 5% CO2. Frumurnar voru meðhöndlaðar með 100 μM KAND 11, kúmamonamsýru 6, kúmamonamíði 1, 100 ng/ml kólcemíði (Gibco) eða 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) í 6 klst. við 37°C. Frumurnar voru festar með MetOH í 10 mínútur og síðan með asetati í 5 mínútur við stofuhita. Festar frumur voru ræktaðar með β-túbúlín frummótefni (1D4A4, Proteintech: 66240-1) þynntu í 0,5% BSA/PBS í 2 klukkustundir, þvegnar 3 sinnum með TBST og síðan ræktaðar með Alexa Fluor geitamótefni. 488 1 klukkustund. – Mús IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) og 15 ng/ml 4′,6-díamídínó-2-fenýlindól (DAPI) þynnt í 0,5% BSA/PBS. Eftir þrisvar sinnum þvott með TBST voru litaðar frumur skoðaðar í öfugum smásjá frá Nikon Eclipse Ti-E. Myndir voru teknar með kældri Hamamatsu ORCA-R2 CCD myndavél með MetaMorph hugbúnaði (Molecular Devices).
Birtingartími: 17. júní 2024