Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com.Útgáfan af vafranum sem þú notar hefur takmarkaðan CSS stuðning.Til að ná sem bestum árangri mælum við með því að þú notir nýrri útgáfu af vafranum þínum (eða slökkva á eindrægnistillingu í Internet Explorer).Í millitíðinni, til að tryggja áframhaldandi stuðning, sýnum við síðuna án stíls eða JavaScript.
Uppgötvun og gagnleg notkun náttúrulegra vara getur hjálpað til við að bæta mannlífið.Efni sem hindra vöxt plantna eru mikið notuð sem illgresiseyðir til að stjórna illgresi.Vegna nauðsyn þess að nota mismunandi tegundir illgresiseyða er þörf á að bera kennsl á efnasambönd með nýja verkunarhátt.Í þessari rannsókn uppgötvuðum við nýtt N-alkoxýpýrról efnasamband, kúmamonamíð, frá Streptomyces werraensis MK493-CF1 og kom á fullkomnu nýmyndunarferlinu.Með líffræðilegum virknimælingum komumst við að því að urs-mónóamsýra er tilbúið milliefni urs-mónóamíðs og hugsanlegtplöntuvaxtarhemill.Að auki höfum við þróað ýmsar urbenonic sýruafleiður, þar á meðal urbenyloxy afleiðuna (UDA), sem hefur mikla illgresiseyðandi virkni án þess að hafa neikvæð áhrif á vöxt HeLa frumna.Við komumst líka að því að úrmótónsýruafleiður trufla örpípla plantna;auk þess hefur KAND áhrif á aktínþráða og veldur frumudauða;Þessi margþættu áhrif eru frábrugðin áhrifum þekktra örpíplahemla og benda til nýs verkunarmáta fyrir ursonic sýru, sem er mikilvægur kostur við þróun nýrra illgresiseyða.
Uppgötvun og hagnýt notkun gagnlegra náttúruvara og afleiða þeirra er leið til að bæta lífsgæði mannsins.Afleidd umbrotsefni framleidd af örverum, plöntum og skordýrum hafa leitt til mikilla framfara í læknisfræði og landbúnaði.Mörg sýklalyf og lyf gegn hvítblæði hafa verið þróuð úr náttúrulegum vörum.Auk þess eru ýmsar gerðir afskordýraeitur, eru sveppa- og illgresiseyðir unnin úr þessum náttúruvörum til notkunar í landbúnaði.Einkum eru illgresiseyðir mikilvæg verkfæri til að auka uppskeru í nútíma landbúnaði og ýmsar tegundir efnasambanda eru þegar notaðar í atvinnuskyni.Nokkrir frumuferli í plöntum, svo sem ljóstillífun, amínósýruefnaskipti, frumuveggmyndun, stjórnun á mítósu, plöntuhormónaboð eða próteinmyndun, eru talin dæmigerð markmið illgresiseyða.Efnasambönd sem hindra starfsemi örpípla eru algengur flokkur illgresiseyða sem hafa áhrif á vöxt plantna með því að hafa áhrif á mítósustjórnun2.
Örpíplar eru hluti af frumubeinagrindinni og eru víða varðveitt í heilkjörnungafrumum.Túbúlín heteródímer samanstendur af α-túbúlíni og β-túbúlíni sem mynda línuleg örpípla frumþráða, með 13 frumþráðum sem mynda sívala uppbyggingu.Örpíplar gegna mörgum hlutverkum í plöntufrumum, þar á meðal ákvarða frumuform, frumuskiptingu og innanfrumuflutninga3,4.Plöntufrumur innihalda örpípla undir millifasa plasmahimnu og eru þessar svokölluðu barkarmíkrópíplar taldar stjórna skipulagi sellulósaörtrefja með því að stjórna sellulósasyntasa fléttum4,5.Cortical örpíplar rótarhúðfrumna, sem eru til staðar á svæði hraðlengingar rótaroddsins, eru staðsett til hliðar og sellulósaörtrefjar fylgja þessum örpíplum og takmarka stefnu frumuþenslu og stuðla þannig að anisotropic frumulengingu.Þess vegna er virkni örpípla nátengd formgerð plantna.Amínósýruskipti í genum sem kóða túbúlín valda skekkju á cortical microtubule arrays og vinstri eða hægri hliðarvexti í Arabidopsis 6,7.Á sama hátt geta stökkbreytingar í próteinum tengdum örpíplum sem stjórna gangverki örpípla einnig leitt til brenglaðs rótarvaxtar8,9,10,11,12,13.Að auki veldur meðferð með illgresi sem truflar örpípla eins og disopyramide, einnig þekkt sem pretilachlor, einnig vinstri hliðar skárótarvexti14.Þessar upplýsingar benda til þess að nákvæm stjórnun á starfsemi örpípla sé mikilvæg til að ákvarða stefnu vaxtar plantna.
Ýmsar tegundir örpíplahemla hafa fundist og hafa þessi lyf lagt mikið af mörkum til rannsókna á frumubeinagrind, sem og landbúnaði og læknisfræði2.Sérstaklega geta oryzalin, dinitroaniline efnasambönd, disopyramide, bensamíð-tengd efnasambönd og hliðstæður þeirra hamlað virkni örpípla og hindrað þar með vöxt plantna.Þess vegna eru þau mikið notuð sem illgresiseyðir.Hins vegar, þar sem örpíplar eru mikilvægur hluti af plöntu- og dýrafrumum, eru flestir örpíplahemlar frumudrepandi fyrir báðar frumugerðirnar.Þess vegna, þrátt fyrir viðurkennt notagildi þeirra sem illgresiseyðar, er takmarkaður fjöldi örverueyðandi efna notaður í hagnýtum tilgangi.
Streptomyces er ættkvísl Streptomyces fjölskyldunnar, sem inniheldur loftháðar, gram-jákvæðar, þráðlaga bakteríur og er víða þekkt fyrir getu sína til að framleiða margs konar efri umbrotsefni.Þess vegna er það talið ein mikilvægasta uppspretta nýrra líffræðilega virkra náttúruafurða.Í núverandi rannsókn uppgötvuðum við nýtt efnasamband sem kallast coumamonamide, sem var einangrað úr Streptomyces werraensis MK493-CF1 og S. werraensis ISP 5486. Með litrófsgreiningu og fullri litrófsgreiningu var uppbygging kúmamonamíðs einkennd og einstök N-alkoxýpýrról beinagrind þess. var ákveðinn.nýmyndun.Úrsmónsýra, tilbúið milliefni ursmónóamíðs og afleiða þess, reyndist hindra vöxt og spírun hinnar vinsælu fyrirmyndarplöntu Arabidopsis thaliana.Í rannsókn á samböndum á uppbyggingu og virkni komumst við að því að efnasamband með C9 breytt í úrsónsýru, kallað nónýloxýafleiða úrsónsýru (KAND), eykur marktækt hamlandi áhrif á vöxt og spírun.Athyglisvert er að nýuppgötvaði plöntuvaxtarhemill hafði einnig áhrif á vöxt tóbaks og lifrarjurtar og var ekki frumudrepandi fyrir bakteríur eða HeLa frumur.Þar að auki framkalla sumar úrmótónsýruafleiður brenglaða rótarsvipgerð, sem gefur til kynna að þessar afleiður hafi beint eða óbeint áhrif á örpípla.Í samræmi við þessa hugmynd benda athuganir okkar á örpíplum merktum annað hvort ónæmisvefjaefnafræðilega eða með flúrljómandi próteinum að KAND meðferð affjölliðar örpíplum.Að auki truflaði meðferð með kúmamótónsýruafleiðum aktín örþráðum.Þannig höfum við uppgötvað nýjan plöntuvaxtarhemla þar sem einstaka verkunarháttur hans felur í sér eyðingu frumubeina.
Stofn MK493-CF1 var einangruð úr jarðvegi í Shinagawa-ku, Tókýó.Stofn MK493-CF1 myndaði vel greinótt stromal mycelium.Hlutaröð 16S ríbósóma RNA gensins (1422 bp) var ákvörðuð.Þessi stofn er mjög líkur S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: dæmigerður stofn, 99,93%).Á grundvelli þessarar niðurstöðu var komist að því að þessi stofn væri náskyld tegundarstofni S. werraensis.Þess vegna nefndum við þennan stofn til bráðabirgða S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T framleiðir einnig sömu lífvirku efnasamböndin.Þar sem lítið var um rannsóknir á því að fá náttúrulegar afurðir úr þessari örveru voru gerðar frekari efnarannsóknir.Eftir ræktun á S. werraensis MK493-CF1 á byggmiðli með gerjun í föstu formi við 30°C í 14 daga, var miðillinn dreginn út með 50% EtOH.60 ml af sýni voru þurrkaðir til að fá 59,5 mg af hráefni.Hráa útdrátturinn var látinn fara í öfugfasa HPLC til að gefa N-metoxý-1H-pýrról-2-karboxamíð (1, nefnt kúamónamíð, 36,0 mg).Heildarmagn 1 er um það bil 60% af hráefninu.Þess vegna ákváðum við að rannsaka ítarlega eiginleika kumamotoamide 1.
Kúmamonamíð 1 er hvítt formlaust duft og háupplausnarmassagreining (HRESIMS) staðfestir C6H8N2O2 (mynd 1).C2-útskipt pýrról bút þessa efnasambands einkennist af δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH í 1H NMR litróf: 4,5 Hz , H-5) og δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), og 13C NMR litrófið sýnir nærveru fjögurra sp2 kolefnisatóma.Tilvist amíðhóps í C2 stöðunni var metin með HMBC fylgni frá C-3 róteindinni til amíðkarbónýl kolefnisins við δC 161,1.Að auki gefa 1H og 13C NMR toppar við δH 4,10 (3H, S) og δC 68,3 til kynna nærveru N-metoxýhópa í sameindinni.Þrátt fyrir að rétt staða metoxýhópsins hafi ekki enn verið ákvörðuð með litrófsgreiningu eins og aukinni munurrófsgreiningu og kjarna-Overhauser skammstöfun (NOEDF), varð N-metoxý-1H-pýrról-2-karboxamíð fyrsta umsóknarefnasambandið.
Til að ákvarða rétta uppbyggingu 1 var gerð heildarmyndun (mynd 2a).Meðhöndlun á 2-amínópýridíni 2 sem fæst í verslun með m-CPBA leiddi til samsvarandi N-oxíðs 3 í magnbundinni ávöxtun.Eftir 2-amínóasíðun 2 var hringþéttingarhvarfið sem lýst er af Abramovich framkvæmt í benseni við 90°C til að fá æskilegt 1-hýdroxý-1H-pýrról-2-karbónítríl 5 í grömmum.Hraði 60% (tvö stig).15,16.Metýlering og vatnsrof á 4 gaf síðan 1-metoxý-1H-pýrról-2-karboxýlsýru (kallað „cumotónsýra“, 6) með góðri afrakstur (70%, tvö þrep).Að lokum gaf amíðun með sýruklóríð milliefni 6 með því að nota vatnskennt ammoníak Kumamoto amíð 1 í 98% ávöxtun.Öll litrófsgögn myndaðs 1 voru svipuð og einangraðs 1, þannig að uppbygging 1 var ákvörðuð;
Almenn nýmyndun og greining á líffræðilegri virkni urbenamíðs og urbenic sýru.(a) Heildarmyndun Kumamoto amíðs.(b) Sjö daga gamlar villigerð Arabidopsis Columbia (Col) plöntur voru ræktaðar á Murashige og Skoog (MS) plötum sem innihéldu coumamonamide 6 eða coumamonamide 1 við tilgreindan styrk.Skalastöng = 1 cm.
Í fyrsta lagi metum við líffræðilega virkni urbenamíðs og milliefna þess með tilliti til getu þeirra til að stilla vöxt plantna.Við bættum ýmsum styrkjum af ursmonamide 1 eða ursmonic acid 6 í MS agar miðil og ræktuðum Arabidopsis thaliana plöntum á þennan miðil.Þessar prófanir sýndu að hár styrkur (500 μM) af 6 hamlaði rótarvexti (mynd 2b).Næst bjuggum við til ýmsar afleiður með því að skipta út N1 stöðu 6 og gerðum rannsóknir á samböndum á uppbyggingu og virkni á þeim (hliðrænu nýmyndunarferlinu er lýst í Stuðningsupplýsingunum (SI)).Arabidopsis plöntur voru ræktaðar á æti sem innihélt 50 μM úrsónsýruafleiður og rótarlengd mæld.eins og sést á myndinni.Eins og sýnt er á myndum 3a, b og S1 hafa kúamósýrur mismunandi lengdar línulegra alkoxýkeðja (9, 10, 11, 12 og 13) eða stórar alkoxýkeðjur (15, 16 og 17) í N1 stöðunni.Afleiðurnar sýndu marktæka hömlun á rótarvexti.Að auki komumst við að því að notkun 200 μM 10, 11 eða 17 hamlaði spírun (Mynd 3c og S2).
Rannsókn á uppbyggingu-virkni sambandi Kumamoto amíðs og skyldra efnasambanda.(a) Uppbygging og myndun hliðstæða.(b) Magngreining á rótarlengd 7 daga gamalla ungplöntur sem ræktaðar eru á MS æti með eða án 50 μM kúamónamíðafleiða.Stjörnumerki gefa til kynna marktækan mun á sýndarmeðferð (t próf, bls< 0,05).n>18. Gögn eru sýnd sem meðaltal ± SD.nt þýðir „ekki prófað“ vegna þess að meira en 50% fræanna spíruðu ekki.(c) Magngreining á spírunarhraða meðhöndlaðra fræja sem ræktað er í 7 daga í MS æti með eða án 200 μM kúamónamíðs og skyldra efnasambanda.Stjörnumerki gefa til kynna marktækan mun á sýndarmeðferð (kí-kvaðratpróf).n=96.
Athyglisvert er að viðbót alkýl hliðarkeðja lengri en C9 dró úr hamlandi virkni, sem bendir til þess að kumamotoic sýrutengd efnasambönd þurfi hliðarkeðjur af ákveðinni stærð til að sýna líffræðilega virkni þeirra.
Vegna þess að greining á tengslamyndun og virkni sýndi að C9 var breytt í úrsónsýru og nónýloxýafleiða úrsónsýru (hér eftir nefnt KAND 11) var áhrifaríkasti plöntuvaxtarhemillinn, gerðum við ítarlegri lýsingu á KAND 11. Meðferð við Arabidopsis með 50 μM KAND 11 kom nánast algjörlega í veg fyrir spírun, en lægri styrkur (40, 30, 20 eða 10 μM) af KAND 11 hamlaði rótarvexti á skammtaháðan hátt (mynd 4a, b).Til að prófa hvort KAND 11 hafi áhrif á lífvænleika rótmeristems skoðuðum við rótmeristem lituð með própidíumjoðíði (PI) og mældum stærð meristems.Stærð meristem ungplöntur sem ræktaðar voru á miðli sem innihélt 25 μM KAND-11 var 151,1 ± 32,5 μm, en stærð meristem plöntur sem ræktaðar voru á viðmiðunarmiðli sem innihélt DMSO var 264,7 ± 30,8 μm (Mynd 4c, d) , sem gefur til kynna að KAND-11 endurheimtir frumuvirkni.breiða út.Root meristem.Í samræmi við þetta minnkaði KAND 11 meðferð magn frumuskiptamerkja CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS merki í rótarmeristeminu (Mynd 4e) 17 .Þessar niðurstöður benda til þess að KAND 11 hamli rótarvexti með því að draga úr frumufjölgunarvirkni.
Greining á hamlandi áhrifum úrbenónsýruafleiða (úrbenýloxýafleiða) á vöxt.(a) 7 daga gamlar villitegundar Col plöntur sem ræktaðar eru á MS plötum með tilgreindum styrk KAND 11. Kvarðastöng = 1 cm.(b) Magngreining á lengd rótar.Bókstafir gefa til kynna verulegan mun (Tukey HSD próf, bls< 0,05).n>16. Gögn eru sýnd sem meðaltal ± SD.(c) Confocal smásjárskoðun á própídínjoðíð lituðum villigerð Col rótum sem ræktaðar eru á MS plötum með eða án 25 μM KAND 11. Hvítar svigar gefa til kynna rót meristem.Skalastrik = 100 µm.(d) Magngreining á stærð rótmeristems (n = 10 til 11).Tölfræðilegur munur var ákvarðaður með því að nota t-próf (bls< 0,05).Súlurnar tákna meðalstærð meristems.(e) Differential interference contrast (DIC) smásjá á rótmeristem sem inniheldur CDKB2 smíðina;1pro: CDKB2;1-GUS lituð og lituð á 5 daga gömlum plöntum ræktaðar á MS plötum með eða án 25 µM KAND prófunar.
Gróðureiturhrif KAND 11 voru prófuð frekar með því að nota aðra tvíkímblaða plöntu, tóbak (Nicotiana tabacum), og stóra landplöntulíkan lífveru, lifrarjurt (Marchantia polymorpha).Eins og í tilfelli Arabidopsis, tóbaks SR-1 plöntur ræktaðar á miðli sem innihélt 25 μM KAND 11 framleiddu styttri rætur (mynd 5a).Að auki spíruðu 40 af 48 fræjum á plötum sem innihéldu 200 μM KAND 11, en öll 48 fræin spíruðu á sýndarmeðhöndluðum miðlum, sem bendir til þess að hærri styrkur KAND hafi verið marktækur (p.< 0,05;chi test -square) hamlaði spírun tóbaks.(Mynd 5b).Auk þess var styrkur KAND 11 sem hamlaði bakteríuvöxt í lifrarplöntu svipað og virkur styrkur í Arabidopsis (mynd 5c).Þessar niðurstöður benda til þess að KAND 11 geti hamlað vexti ýmissa plantna.Við könnuðum síðan hugsanlega frumueiturhrif bjarnamónóamíðtengdra efnasambanda í öðrum lífverum, nefnilega manna HeLa frumum og Escherichia coli stofni DH5α, sem fulltrúar hærri dýrafrumna og bakteríufrumna, í sömu röð.Í röð frumufjölgunarprófa sáum við að kúamónamíð 1, kúmónamíðsýra 6 og KAND 11 höfðu ekki áhrif á vöxt HeLa eða E. coli frumna við styrkleika 100 μM (mynd 5d, e).
Vaxtarhömlun á KAND 11 í lífverum sem ekki eru Arabidopsis.(a) Tveggja vikna gamlar villigerð SR-1 tóbaksplöntur voru ræktaðar á lóðréttum MS plötum sem innihéldu 25 μM KAND 11. (b) Tveggja vikna gamlar villigerð SR-1 tóbaksplöntur voru ræktaðar á láréttum stað. MS plötur sem innihalda 200 μM KAND 11. (c) Tveggja vikna gamlir villigerð Tak-1 lifrarfrumur ræktaðir á Gamborg B5 plötum með tilgreindum styrk KAND 11. Rauðar örvar gefa til kynna gró sem hættu að vaxa innan tveggja vikna ræktunar tímabil.(d) Frumufjölgunargreining á HeLa frumum.Fjöldi lífvænlegra frumna var mældur með föstu millibili með því að nota frumutalningarsett 8 (Dojindo).Sem viðmiðun voru HeLa frumur meðhöndlaðar með 5 μg/ml actinomycin D (Act D), sem hamlar umritun RNA pólýmerasa og veldur frumudauða.Greiningar voru gerðar í þríriti.(e) E. coli frumufjölgunarprófun.Vöxtur E. coli var greindur með því að mæla OD600.Til viðmiðunar voru frumur meðhöndlaðar með 50 μg/ml ampicillíni (Amp), sem hindrar myndun frumuveggja baktería.Greiningar voru gerðar í þríriti.
Til að ráða verkunarmáta frumueiturhrifa af völdum úramíðtengdra efnasambanda, endurgreindum við urbenic sýruafleiður með miðlungs hamlandi áhrif.eins og sést á myndinni.Eins og sýnt er á myndum 2b, 6a framleiddu plöntur sem ræktaðar voru á agarplötum sem innihéldu háan styrk (200 μM) af úrmótónsýru 6 styttri og vinstri bogadregnar rætur (θ = – 23,7 ± 6,1), en af plöntum sem ræktaðar voru á viðmiðunarmiðlinum, plöntur mynduðu nánast beinar rætur (θ = – 3,8 ± 7,1).Vitað er að þessi einkennandi skávöxtur stafar af vanstarfsemi smápípla í heilaberki14,18.Í samræmi við þessa niðurstöðu ollu örpíplaörvandi lyfin disopyramide og oryzalin svipaða rótarhalla við vaxtarskilyrði okkar (myndir 2b, 6a).Á sama tíma prófuðum við úrmótónsýruafleiður og völdum nokkrar þeirra sem, í vissum styrk, ollu skárótarvexti.Efnasambönd 8, 9 og 15 breyttu stefnu rótarvaxtar við 75 μM, 50 μM og 40 μM, í sömu röð, sem gefur til kynna að þessi efnasambönd geti í raun óstöðugleika örpípla (mynd 2b, 6a).Við prófuðum einnig öflugustu ursólsýruafleiðuna, KAND 11, í lægri styrk (15 µM) og komumst að því að notkun KAND 11 hamlaði rótarvexti og að rótvaxtarstefnan var ójöfn, þó þær hafi tilhneigingu til að halla til vinstri ( mynd C3)..Vegna þess að hærri styrkur örpíplaörvandi lyfja hindrar stundum vöxt plantna frekar en að valda halla rótum, metum við í kjölfarið möguleikann á því að KAND 11 hafi áhrif á örpípla með því að fylgjast með örpíplum í heilaberki í húðþekjufrumum rótar.Ónæmisvefjaefnafræði með því að nota and-β-túbúlín mótefni í húðþekjufrumum plönturóta sem voru meðhöndlaðir með 25 μM KAND 11 sýndi hvarf næstum allra barkarmíkrópípla í húðþekjufrumum á lengingarsvæðinu (mynd 6b).Þessar niðurstöður benda til þess að kúmamótónsýra og afleiður hennar verka beint eða óbeint á örpípla til að trufla þau og að þessi efnasambönd séu nýir örpíplahemlar.
Ursonic sýra og afleiður hennar breyta cortical microtubules í Arabidopsis thaliana.(a) Rótarhalli mældur í viðurvist ýmissa úrmótónsýruafleiða við tilgreindan styrk.Áhrif tveggja efna sem vitað er að hamla örpíplum: disopyramide og oryzalin voru einnig greind.Innfellingin sýnir staðalinn sem notaður er til að mæla vaxtarhorn rótar.Stjörnumerki gefa til kynna marktækan mun á sýndarmeðferð (t próf, bls< 0,05).n>19. Skalastöng = 1 cm.(b) Cortical microtubules í húðþekjufrumum á lengingarsvæðinu.Örpíplar í villigerð Arabidopsis Col rótum sem ræktaðar voru á MS plötum með eða án 25 μM KAND 11 voru sýndar með ónæmisvefjaefnafræðilegri litun með því að nota β-tubulin frummótefni og Alexa Fluor-tengd aukamótefni.Skalastrik = 10 µm.(c) Mítóísk uppbygging örpípla í rótmeristem.Örpíplar voru sýndar með ónæmisvefjaefnafræðilegri litun.Mítótísk mannvirki, þar á meðal prófasóna, snælda og phragmoplasts, voru taldir út frá confocal myndum.Örvar gefa til kynna mítóískar örpíplabyggingar.Stjörnumerki gefa til kynna marktækan mun á sýndarmeðferð (t próf, bls< 0,05).n>9. Kvarðastöng = 50 µm.
Þrátt fyrir að Ursa hafi getu til að trufla starfsemi örpípla, er búist við að verkunarháttur þess sé frábrugðinn dæmigerðum örpípluaffjölliðunarefnum.Til dæmis, hærri styrkur örpíplaaffjölliðunarefna eins og disopyramide og oryzalin framkallar anisotropic stækkun húðþekjufrumna, en KAND 11 gerir það ekki.Að auki, sambeiting KAND 11 og disopyramide leiddi til samsettrar disopyramide-völdum rótarvaxtarsvörun og KAND 11-framkallaða vaxtarhömlun kom fram (mynd S4).Við greindum einnig svörun ofnæma tvísópýramíðs 1-1 (phs1-1) stökkbreytileikans við KAND 11. phs1-1 er með stökkbreytingu sem ekki er kanónísk túbúlínkínasa og myndar styttri rætur þegar hann er meðhöndlaður með disópýramíði9,20.phs1-1 stökkbreyttar plöntur sem ræktaðar voru á agarmiðli sem innihélt KAND 11 höfðu styttri rætur svipaðar þeim sem ræktaðar voru á disopyramid (mynd S5).
Að auki sáum við mítótísk örpíplabyggingu, svo sem prófasóna, snælda og phragmoplasts, í rótmeristem plöntur sem voru meðhöndlaðir með KAND 11. Í samræmi við athuganir fyrir CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, veruleg lækkun á fjöldi mítótískra örpípla sást (mynd .6c).
Til að einkenna frumueiturhrif KAND 11 við undirfrumuupplausn, meðhöndluðum við tóbaks BY-2 sviflausnarfrumur með KAND 11 og fylgdumst með svörun þeirra.Við bættum fyrst KAND 11 við BY-2 frumur sem tjá TagRFP-TUA6, sem flúrljómandi merkir örpípla, til að meta áhrif KAND 11 á örpípla í heilaberki.Þéttleiki smápípla í heilaberki var metinn með myndgreiningu, sem mældi hlutfall umfrymispixla meðal umfrymispixla.Niðurstöður mælinga sýndu að eftir meðferð með 50 μM eða 100 μM KAND 11 í 1 klukkustund minnkaði þéttleikinn marktækt í 0,94 ± 0,74% eða 0,23 ± 0,28%, í sömu röð, en þéttleiki frumna meðhöndlaðar með DMSO nam 34 ± 10 . % (Mynd 7a).Þessar niðurstöður eru í samræmi við athugunina í Arabidopsis að KAND 11 meðferð veldur affjölliðun á heilapíplum í heilaberki (mynd 6b).Við skoðuðum einnig BY-2 línuna með GFP-ABD merktum aktínþráðum eftir meðferð með sama styrk KAND 11 og sáum að KAND 11 meðferð truflaði aktínþræðina.Meðferð með 50 μM eða 100 μM KAND 11 í 1 klst. minnkaði þéttleika aktínþráða marktækt í 1,20 ± 0,62% eða 0,61 ± 0,26%, í sömu röð, en þéttleiki í DMSO-meðhöndluðum frumum var 1,69 ± 0,52% (fig.7b).Þessar niðurstöður eru andstæðar áhrifum própýsamíðs, sem hefur ekki áhrif á aktínþráða, og latrunculin B, aktínaffjölliðunarefnis sem hefur ekki áhrif á örpípla (SI mynd S6).Að auki hafði meðferð með coumamonamide 1, coumamonamide sýru 6 eða KAND 11 ekki áhrif á örpípla í HeLa frumum (SI mynd S7).Þannig er talið að verkunarmáti KAND 11 sé frábrugðinn verkunarmáti þekktra frumubeinagrindraskaða.Að auki leiddi smásæ athugun okkar á BY-2 frumum meðhöndlaðar með KAND 11 upphaf frumudauða við KAND 11 meðferð og sýndi að hlutfall Evans blálitaðra dauðra frumna jókst ekki marktækt eftir 30 mínútur af KAND 11 meðferð, en eftir 90 mínútna meðferð með 50 μM eða 100 μM KAND jókst fjöldi dauðra frumna í 43,7% eða 80,1%, í sömu röð (Mynd 7c).Samanlagt benda þessi gögn til þess að nýja ursólsýruafleiðan KAND 11 sé plöntusértækur frumubeinagrindhemill með áður óþekktan verkunarmáta.
KAND hefur áhrif á örpípla í heilaberki, aktínþráðum og lífvænleika BY-2 tóbaksfrumna.(a) Sjónmynd af örpíplum í heilaberki í BY-2 frumum í viðurvist TagRFP-TUA6.BY-2 frumur meðhöndlaðar með KAND 11 (50 μM eða 100 μM) eða DMSO voru skoðaðar með confocal smásjá.Þéttleiki smápípla í heilaberki var reiknaður út frá smámyndum af 25 sjálfstæðum frumum.Bókstafir gefa til kynna verulegan mun (Tukey HSD próf, bls< 0,05).Skalastrik = 10 µm.(b) Barkaraktínþræðir í BY-2 frumum sýndar í viðurvist GFP-ABD2.BY-2 frumur meðhöndlaðar með KAND 11 (50 μM eða 100 μM) eða DMSO voru skoðaðar með confocal smásjá.Þéttleiki aktínþráða í heilaberki var reiknaður út frá smámyndum af 25 sjálfstæðum frumum.Bókstafir gefa til kynna verulegan mun (Tukey HSD próf, bls< 0,05).Skalastrik = 10 µm.(c) Athugun á dauðum BY-2 frumum með Evans blálitun.BY-2 frumur meðhöndlaðar með KAND 11 (50 μM eða 100 μM) eða DMSO voru skoðaðar með ljóssviðssmásjá.n=3.Skalastrik = 100 µm.
Uppgötvun og notkun nýrra náttúruvara hefur leitt til verulegra framfara í ýmsum þáttum mannlífsins, þar á meðal læknisfræði og landbúnaði.Sögulegar rannsóknir hafa verið gerðar til að fá gagnleg efnasambönd úr náttúruauðlindum.Sérstaklega er vitað að actinomycetes eru gagnlegar sem sníklaeyðandi sýklalyf fyrir þráðorma vegna getu þeirra til að framleiða ýmis afleidd umbrotsefni eins og avermectin, aðalefnasambandið af ivermectin og bleomycin og afleiður þess, notað til lækninga sem krabbameinslyf21,22.Sömuleiðis hafa margs konar illgresiseyðandi efnasambönd fundist úr actinomycetes, sum þeirra eru þegar notuð í atvinnuskyni1,23.Þess vegna er greining á umbrotsefnum actinomycete til að einangra náttúrulegar vörur með æskilega líffræðilega virkni talin áhrifarík aðferð.Í þessari rannsókn uppgötvuðum við nýtt efnasamband, kúmamonamíð, frá S. werraensis og mynduðum það með góðum árangri.Ursonic acid er tilbúið milliefni úr urbenamíði og afleiðum þess.Það getur valdið einkennandi rótarhring, sýnt miðlungs til sterka illgresiseyðandi virkni og beint eða óbeint skaðað örpípla plantna.Hins vegar getur verkunarháttur úrmótónsýru verið frábrugðinn verkunarháttum örpíplahemla sem fyrir eru, þar sem KAND 11 truflar einnig aktínþráða og veldur frumudauða, sem bendir til stjórnunarferlis þar sem úrmótónsýra og afleiður hennar hafa áhrif á margs konar frumubeinagrind..
Nánari lýsing á úrbenónsýru mun hjálpa til við að skilja betur verkunarmáta úrbenónsýru.Sérstaklega er næsta markmið að meta getu úrsónsýru til að bindast minnkaðri örpíplum til að ákvarða hvort úrsónsýra og afleiður hennar verka beint á örpípla og affjölliða þau, eða hvort verkun þeirra leiði til óstöðugleika í örpíplum.Að auki, ef örpíplar eru ekki beint skotmark, mun auðkenning á verkunarstað og sameindamarkmið ursonic sýru á plöntufrumum hjálpa til við að skilja frekar eiginleika skyldra efnasambanda og mögulegar leiðir til að bæta illgresiseyðandi virkni.Lífvirkniprófun okkar leiddi í ljós einstaka frumudrepandi eiginleika ursonic sýru á vöxt plantna eins og Arabidopsis thaliana, tóbaks og lifrarjurtar, á meðan hvorki E. coli né HeLa frumur voru fyrir áhrifum.Lítil eða engin eituráhrif á dýrafrumur eru kostur við úrsónsýruafleiður ef þær eru þróaðar sem illgresiseyðir til notkunar á opnum landbúnaðarsvæðum.Reyndar, þar sem örpíplar eru algengar mannvirki í heilkjörnungum, er sértæk hömlun þeirra í plöntum lykilskilyrði fyrir illgresiseyði.Til dæmis er própýzamíð, örpíplaaffjölliðunarefni sem binst beint við túbúlín og hindrar fjölliðun, notað sem illgresiseyðir vegna lítillar eiturverkana á dýrafrumur24.Öfugt við dísópýramíð hafa skyld bensamíð mismunandi marksértækni.Auk plöntumörpípla hamlar RH-4032 eða benzoxamíð einnig örpíplum dýrafrumna eða ómpípla, í sömu röð, og zalilamíð er notað sem sveppalyf vegna lítillar eiturverkana á plöntum25,26,27.Nýfundna björninn og afleiður hans sýna sértæka frumueiturhrif gegn plöntum, en það er athyglisvert að frekari breytingar geta breytt marksérhæfni þeirra, hugsanlega veitt viðbótarafleiður til að stjórna sjúkdómsvaldandi sveppum eða ómýtum.
Einstakir eiginleikar úrbenónsýru og afleiða hennar eru gagnlegar fyrir þróun þeirra sem illgresiseyðir og notað sem rannsóknartæki.Mikilvægi frumubeinagrindarinnar við að stjórna lögun plöntufrumna er almennt viðurkennt.Fyrri rannsóknir hafa sýnt að plöntur hafa þróað flókna aðferða við skipulagningu smápípla í heilaberki með því að stjórna gangverki örpípla til að stjórna formgerð á réttan hátt.Mikill fjöldi sameinda sem ber ábyrgð á stjórnun örpíplavirkni hefur verið auðkenndur og tengdar rannsóknir standa enn yfir3,4,28.Núverandi skilningur okkar á gangverki örpípla í plöntufrumum útskýrir ekki að fullu fyrirkomulag örpípla í heilaberki.Til dæmis, þó að bæði disopyramide og oryzalin geti affjölliðu örpípla, veldur disopyramide alvarlegri rótarröskun á meðan oryzalin hefur tiltölulega væg áhrif.Þar að auki, stökkbreytingar í túbúlíni, sem koma á stöðugleika í örpíplum, valda einnig dextrorotation í rótum, en paclitaxel, sem einnig kemur á stöðugleika örpípla, gerir það ekki.Þess vegna ætti að rannsaka og bera kennsl á sameindamarkmið ursólsýru að veita nýja innsýn í stjórnun á plöntuberki örpíplum.Sömuleiðis mun framtíðarsamanburður á efnum sem eru áhrifarík til að stuðla að brengluðum vexti, eins og disopyramide, og minna áhrifaríkum efnum, eins og oryzalin eða kumamotoric sýru, gefa vísbendingar um hvernig brengluð vöxtur á sér stað.
Aftur á móti eru varnartengdar endurröðun frumubeinakerfis annar möguleiki til að útskýra frumueiturhrif ursonic sýru.Sýking sýkingar eða innleiðing elicitor í plöntufrumur veldur stundum eyðileggingu á frumubeinagrindinni og síðari frumudauða29.Til dæmis hefur verið greint frá því að kriptoxantín úr ómýcetum raski örpíplum og aktínþráðum fyrir dauða tóbaksfrumna, svipað og gerist með KAND meðferð30,31.Líkindin á milli varnarviðbragða og frumuviðbragða af völdum ursonic sýru leiddi til þess að við gerðum tilgátu um að þau kveiki á algengum frumuferlum, þó að hraðari og sterkari áhrif ursonic sýru en cryptoxanthin séu augljós.Hins vegar hafa rannsóknir sýnt að truflun á aktínþráðum stuðlar að sjálfsprottnum frumudauða, sem fylgir ekki alltaf truflun á örpíplum29.Auk þess á eftir að koma í ljós hvort annaðhvort sýkillinn eða framkallandi valdi brengluðum rótarvexti eins og ursonic sýruafleiður gera.Þannig er sameindaþekking sem tengir varnarviðbrögð og frumubeinagrind aðlaðandi vandamál sem þarf að takast á við.Með því að nýta sér nærveru efnasambanda með lágan mólþunga sem tengjast ursonic sýru, sem og ýmsum afleiðum með mismunandi styrkleika, geta þau veitt tækifæri til að miða við óþekkt frumukerfi.
Samanlagt mun uppgötvun og notkun nýrra efnasambanda sem móta gangverki örpípla veita öflugar aðferðir til að takast á við flókna sameindaaðferðina sem liggur að baki lögun plantna frumna.Í þessu samhengi getur nýlega þróað efnasamband úrmótónsýra, sem hefur áhrif á örpípla og aktínþráða og framkallar frumudauða, gefið tækifæri til að ráða tengslin milli örpíplustjórnunar og þessara annarra aðferða.Þannig mun efnafræðileg og líffræðileg greining með því að nota úrbenónsýru hjálpa okkur að skilja sameindastjórnunarkerfin sem stjórna umfrymi plöntunnar.
Sáð S. werraensis MK493-CF1 í 500 ml erlenmeyerflösku sem inniheldur 110 ml af fræmiðli sem samanstendur af 2% (w/v) galaktósa, 2% (w/v) Essence paste, 1% (w/v) Bacto samsetningu .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) maísþykkni (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 og 0,2% CaCO3 í afjónuðu vatni.(pH 7,4 fyrir dauðhreinsun).Fræræktirnar voru ræktaðar á snúningshristara (180 rpm) við 27°C í 2 daga.Framleiðsluræktun með gerjun í föstu formi.Fræræktin (7 ml) var flutt í 500 ml K-1 flösku sem innihélt 40 g af framleiðslumiðli sem samanstóð af 15 g af pressuðu byggi (MUSO Co., Ltd., Japan) og 25 g af afjónuðu vatni (pH ekki stillt fyrir dauðhreinsun).).Gerjun var framkvæmd við 30°C í myrkri í 14 daga.Gerjunarefnið var dregið út með 40 ml/flösku EtOH og skilið í skilvindu (1500 g, 4°C, 10 mín).Ræktunarfljótandi vökvinn (60 ml) var dreginn út með blöndu af 10% MeOH/EtOAc.Lífræna lagið var gufað upp við lækkaðan þrýsting til að fá leifar (59,5 mg), sem var sett í HPLC með hallaskolun (0–10 mínútur: 90%) á öfugfasa súlu (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × lengd 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 mínútur: 90% H2O/CH3CN í 70% H2O/CH3CN (halli), 35–45 mínútur: 90% H2O/EtOH, 45–155 mínútur: 90% H2O /EtOH í 100% EtOH (halli (halli), 155–200 mín: 100% EtOH) við flæðihraða 1,5 ml/mín., kúmamonamíð (1, 36,0 mg) var einangrað sem hvítt formlaust duft.
Kumamotoamide(1);1H-NMR (500 MHz, CDCI3) 8 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H).4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCI3) 5 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ reiknað gildi: 141.0659, mæligildi: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 15.
Columbia fræ (Col-0) voru fengin frá Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) með leyfi til rannsóknarnotkunar.Col-0 fræ voru ræktuð og viðhaldið við rannsóknarstofuaðstæður okkar og notuð sem villigerð Arabidopsis plöntur.Arabidopsis fræ voru yfirborðssótthreinsuð og ræktuð í hálfsterkum Murashige og Skoog miðli sem innihélt 2% súkrósa (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morfólínó)etansúlfónsýru (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) ).) og 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, við 23 °C og stöðugt ljós.Fræ phs1-1 stökkbreytileikans voru útveguð af T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Fræ af stofni SR-1 voru veitt af T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) og notuð sem villigerð tóbaksplöntur.Tóbaksfræ voru yfirborðssótthreinsuð og lögð í bleyti í dauðhreinsuðu vatni í þrjár nætur til að stuðla að spírun, síðan sett í hálfstyrka lausn sem innihélt 2% súkrósa, 0,05% (w/v) MES og 0,8% gellangúmmí (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.og Skoog medium) með pH 5,7 og ræktað við 23°C undir stöðugu ljósi.
Stofn Tak-1 var útvegaður af T. Kohchi (Kyoto háskólanum) og var notaður sem staðlað tilraunaeining fyrir lifrarjurtarannsóknina.Gemma var fengin úr dauðhreinsuðum ræktuðum plöntum og síðan húðuð á Gamborg B5 miðli (Fujifilm Wako Pure Chemical) sem innihélt 1% súkrósa og 0,3% gellangúmmí og ræktað við 23°C undir stöðugu ljósi.
Tóbak BY-2 frumur (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) voru útvegaðar af S. Hasezawa (háskólanum í Tókýó).BY-2 frumur voru þynntar 95-falt í breyttum Linsmeier og Skoog miðli og bætt við vikulega með 2,4-díklórfenoxýediksýru 32 .Frumusviflausninni var blandað á snúningshristara við 130 snúninga á mínútu við 27°C í myrkri.Þvoðu frumurnar með 10 sinnum rúmmáli fersks ætis og blandaðu aftur í sama æti.BY-2 erfðabreyttar frumulínur sem tjá örpíplamerkið TagRFP-TUA6 á stöðugan hátt eða aktínþráðamerkið GFP-ABD2 undir blómkálsmósaíkveiru 35S hvataefninu voru mynduð eins og lýst er33,34,35.Þessum frumulínum er hægt að viðhalda og samstilla með því að nota svipaðar aðferðir og notaðar eru fyrir upprunalegu BY-2 frumulínuna.
HeLa frumur voru ræktaðar í Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) ásamt 10% fóstursermi úr nautgripum, 1,2 U/ml penicillíni og 1,2 μg/ml streptomycini í 37°C útungunarvél með 5% CO2.
Allar tilraunir sem lýst er í þessu handriti voru framkvæmdar í samræmi við japanskar líföryggisreglur og leiðbeiningar.
Efnasambönd voru leyst upp í dímetýlsúlfoxíði (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) sem stofnlausnir og þynnt í MS miðli fyrir Arabidopsis og tóbak eða Gamborg B5 miðli fyrir lifrarjurt.Fyrir rótvaxtarhömlunarprófið var meira en 10 fræjum á plötu sáð á agarmiðil sem innihélt tilgreind efnasambönd eða DMSO.Fræ voru ræktuð í vaxtarhólf í 7 daga.Plönturnar voru myndaðar og lengd rótanna mæld.Fyrir Arabidopsis spírunarprófun var 48 fræjum á plötu sáð á agar miðil sem innihélt 200 μM efnasamband eða DMSO.Arabidopsis fræ voru ræktuð í vaxtarhólfi og fjöldi spíraðra ungplöntur talinn 7 dögum eftir spírun (dag).Fyrir spírun tóbaksprófunar var 24 fræjum á plötu sáð á agarmiðil sem innihélt 200 μM KAND eða DMSO.Tóbaksfræ voru ræktuð í vaxtarhólfi og fjöldi spíraðra ungplöntur talinn eftir 14 daga.Fyrir vaxtarhömlunarprófun á lifrarjurtum voru 9 fósturvísar frá hverri plötu sett á agarmiðil sem innihélt tilgreindan styrk af KAND eða DMSO og ræktuð í vaxtarhólf í 14 daga.
Notaðu plöntur litaðar með 5 mg/ml própídíumjoðíði (PI) til að sjá hvernig rót meristem er skipulagt.PI merki sáust með flúrljómunarsmásjá með TCS SPE confocal leysismásjá (Leica Microsystems).
Vefjaefnafræðileg litun á rótum með β-glúkúrónídasa (GUS) var framkvæmd samkvæmt samskiptareglum sem lýst er af Malami og Benfey36.Fræplöntur voru festar í 90% asetoni yfir nótt, litaðar með 0,5 mg/ml 5-bróm-4-klór-3-indólýl-β-d-glúkúrónsýru í GUS jafnalausn í 1 klukkustund og settar í vökvaðri klóraldehýðlausn.(8 g klóralhýdrat, 2 ml af vatni og 1 ml af glýseróli) og sést með mismunatruflun skuggasmásjá með Axio Imager M1 smásjá (Carl Zeiss).
Rótarhorn voru mæld á 7 daga gömlum plöntum sem ræktaðar voru á lóðrétt settum plötum.Mældu horn rótarinnar frá stefnu þyngdarvigursins eins og lýst er í skrefi 6.
Fyrirkomulag smápípla í heilaberki sást eins og lýst er, með smávægilegum breytingum á samskiptareglum 37 .And-β-tubulin mótefni (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) og Alexa Fluor 488-tengd and-mús IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) voru notuð sem frum- og aukamótefni í 1:1000 og 1:100 þynningu, í sömu röð.Flúrljómunarmyndir voru teknar með því að nota TCS SPE confocal laserskönnunarsmásjá (Leica Microsystems).Fáðu Z-stafla myndir og búðu til hámarksstyrkleikavörpun í samræmi við leiðbeiningar framleiðanda.
HeLa frumufjölgunargreining var framkvæmd með því að nota frumutalningarsett 8 (Dojindo) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.
Vöxtur E. coli DH5α var greindur með því að mæla frumuþéttleika í ræktun með litrófsmæli við 600 nm (OD600).
Skipulag frumubeina í erfðabreyttum BY-2 frumum sást með því að nota flúrljómunarsmásjá með CSU-X1 confocal skanna tæki (Yokogawa) og sCMOS myndavél (Zyla, Andor Technology).Þéttleiki frumubeina var metinn með myndgreiningu, sem mældi hlutfall umfrymispixla meðal umfrymispixla í samfóknum myndum með ImageJ hugbúnaði eins og lýst er38,39.
Til að greina frumudauða í BY-2 frumum var skammtur af frumusviflausninni ræktaður með 0,05% Evans blue í 10 mínútur við stofuhita.Sértæk Evans blálitun á dauðum frumum er háð útpressun litarefnisins úr lífvænlegum frumum með ósnortinni plasmahimnu40.Litaðar frumur sáust með því að nota bjartsviðssmásjá (BX53, Olympus).
HeLa frumur voru ræktaðar í DMEM bætt við 10% FBS í rakaðri hitakassa við 37°C og 5% CO2.Frumur voru meðhöndlaðar með 100 μM KAND 11, kumamonamínsýru 6, kumamonamíði 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), eða 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) í 6 klst við 37°C.Frumur voru festar með MetOH í 10 mínútur og síðan með asetati í 5 mínútur við stofuhita.Föst frumur voru ræktaðar með β-túbúlín frummótefni (1D4A4, Proteintech: 66240-1) þynnt í 0,5% BSA/PBS í 2 klukkustundir, þvegnar 3 sinnum með TBST og síðan ræktaðar með Alexa Fluor geitamótefni.488 1 klst.– Mús IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) og 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) þynnt í 0,5% BSA/PBS.Eftir þvott með TBST þrisvar sinnum sáust litaðar frumur á Nikon Eclipse Ti-E öfugum smásjá.Myndir voru teknar með kældri Hamamatsu ORCA-R2 CCD myndavél með MetaMorph hugbúnaði (Molecular Devices).
Pósttími: 17-jún-2024