Furuþráðormurinn er farandsníkjudýr í sóttkví sem vitað er að veldur miklum fjárhagstjóni í vistkerfum furuskóga. Þessi rannsókn fjallar um þráðormaeyðingarvirkni halógenaðra indóla gegn furuþráðormum og verkunarháttum þeirra. Þráðormaeyðingarvirkni 5-joðindóls og avermektíns (jákvæðrar samanburðar) gegn furuþráðormum var svipuð og mikil við lágan styrk (10 μg/ml). 5-joðindól dró úr frjósemi, æxlunargetu, fósturvísis- og lirfudauða og hreyfihegðun. Sameindavíxlverkanir bindla við glútamatstýrða klóríðgangaviðtaka sem eru sértækir fyrir hryggleysingja styðja þá hugmynd að 5-joðindól, eins og avermektín, binst fast við virka stað viðtakans. 5-joðindól olli einnig ýmsum aflögunum á svipgerð þráðormanna, þar á meðal óeðlilegu hruni/rýrnun líffæra og aukinni safabólumyndun. Þessar niðurstöður benda til þess að safabólur geti gegnt hlutverki í dauða þráðormanna vegna metýleringar. Mikilvægt er að hafa í huga að 5-joðindól var ekki eitrað fyrir báðar plöntutegundir (hvítkál og radísur). Þessi rannsókn sýnir því fram á að notkun joðindóls við umhverfisaðstæður getur stjórnað visnunarskaða furu.
Furutráðormurinn (Bursaphelenchus xylophilus) tilheyrir furutráðormunum (PWN), farþegaþráðormum sem eru þekktir fyrir að valda miklum vistfræðilegum skaða á vistkerfum furuskóga1. Visnunarsjúkdómur furu (PWD) af völdum furutráðormsins er að verða alvarlegt vandamál á nokkrum heimsálfum, þar á meðal Asíu og Evrópu, og í Norður-Ameríku eyðileggur þráðormurinn innfluttar furutegundir1,2. Hnignun furutrjáa er stórt efnahagslegt vandamál og horfur á útbreiðslu hennar um allan heim eru áhyggjuefni3. Eftirfarandi furutegundir eru oftast ráðist af þráðorminum: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii og Pinus radiata4. Furutráðormurinn er alvarlegur sjúkdómur sem getur drepið furutré innan vikna eða mánaða frá smiti. Að auki eru útbreiðslur furutráðorma algengar í ýmsum vistkerfum, þannig að viðvarandi smitkeðjur hafa myndast1.
Bursaphelenchus xylophilus er sóttkvíarþráðormur sem tilheyrir yfirættinni Aphelenchoidea og ættkvísl 102.5. Þráðormurinn nærist á sveppum og fjölgar sér í viðarvefjum furutrjáa og þróast í fjögur mismunandi lirfustig: L1, L2, L3, L4 og fullorðinn einstakling1,6. Við fæðuskort fer furuþráðormurinn yfir í sérhæft lirfustig – dauer, sem sníkjudýr leggur á furubjölluna (Monochamus alternatus) og flyst yfir í heilbrigðar furutré. Í heilbrigðum hýslum ferðast þráðormarnir hratt í gegnum plöntuvefi og nærast á vefjafrumum, sem leiðir til fjölda ofnæmisviðbragða, visnunar og dauða furu innan árs frá smiti1,7,8.
Líffræðileg stjórnun á furunamatóðum hefur lengi verið áskorun og sóttkvíaraðgerðir ná aftur til 20. aldar. Núverandi aðferðir til að stjórna furunamatóðum fela aðallega í sér efnameðferð, þar á meðal viðarreykingu og ígræðslu þráðormaeiturs í trjáboli. Algengustu þráðormaeitur eru avermectin og avermectin benzoate, sem tilheyra avermectin fjölskyldunni. Þessi dýru efni eru mjög áhrifarík gegn mörgum þráðormategundir og eru talin umhverfisvæn9. Hins vegar er búist við að endurtekin notkun þessara þráðormaeiturs muni skapa úrvalsþrýsting sem mun næstum örugglega leiða til þess að ónæmar furunamatóður komi fram, eins og hefur verið sýnt fram á fyrir nokkur skordýraeitur, svo sem Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella og þráðormana Trichostrongylus colubriformis og Ostertagia circumcincta, sem hafa smám saman þróað með sér ónæmi fyrir avermectin10,11,12. Þess vegna þarf að rannsaka ónæmismynstur reglulega og skima stöðugt fyrir þráðormaeitur til að finna aðrar, hagkvæmar og umhverfisvænar aðferðir til að stjórna PVD. Á undanförnum áratugum hafa fjölmargir höfundar lagt til notkunar plöntuútdráttar, ilmkjarnaolía og rokgjörnra efna sem þráðormaeitureyðingarefni13,14,15,16.
Við sýndum nýlega fram á nematadrepandi virkni indóls, sem er millifrumu- og milliríkjaboðasameind, í Caenorhabditis elegans 17. Indól er útbreitt innanfrumuboðefni í örveruvistfræði og stjórnar fjölmörgum störfum sem hafa áhrif á örverufræðilega lífeðlisfræði, grómyndun, stöðugleika plasmíða, lyfjaónæmi, myndun líffilmu og meinvirkni 18, 19. Virkni indóls og afleiða þess gegn öðrum sjúkdómsvaldandi þráðormum hefur ekki verið rannsökuð. Í þessari rannsókn könnuðum við nematadrepandi virkni 34 indóla gegn furuþráðormum og skýrðum verkunarháttur öflugasta 5-joðindólsins með því að nota smásjárskoðun, tímamælda ljósmyndun og sameindatengingartilraunir, og metum eituráhrif þess á plöntur með því að nota spírunarpróf á fræjum.
Áður hefur verið greint frá því að hár styrkur (>1,0 mM) af indóli hafi þráðormaeyðandi áhrif á þráðorma17. Eftir meðferð á B. xylophilus (blönduðum lífsstigum) með indóli eða 33 mismunandi indólafleiðum við 1 mM styrk, var dánartíðni B. xylophilus mæld með því að telja lifandi og dauða þráðorma í samanburðar- og meðhöndluðum hópum. Fimm indól sýndu marktæka þráðormaeyðandi virkni; lifun ómeðhöndlaðs samanburðarhóps var 95 ± 7% eftir 24 klst. Af þeim 34 indólum sem prófuð voru, ollu 5-joðindól og 4-flúorindól við 1 mM 100% dánartíðni, en 5,6-díflúorindígó, metýlindól-7-karboxýlat og 7-joðindól ollu um það bil 50% dánartíðni (Tafla 1).
Áhrif 5-joðindóls á myndun og efnaskipti safabóla í furuþráðormum. (A) Áhrif avermektíns og 5-joðindóls á fullorðna karlkyns þráðorma, (B) egg þráðorma á L1 stigi og (C) efnaskipti B. xylophilus, (i) safabólur sáust ekki eftir 0 klst., meðferð leiddi til (ii) safabóla, (iii) uppsöfnunar margra safabóla, (iv) bólgu í safabólum, (v) samruna safabóla og (vi) myndunar risa safabóla. Rauðar örvar gefa til kynna bólgu í safabólum, bláar örvar gefa til kynna samruna safabóla og svartar örvar gefa til kynna risa safabólur. Kvarðastika = 50 μm.
Að auki lýsti þessi rannsókn einnig raðbundnu ferli metan-völdum dauða í furuþráðormum (Mynd 4C). Metanógenískur dauði er frumudauði sem ekki tengist frumudauða og tengist uppsöfnun áberandi safabóla í umfrymi27. Formfræðilegir gallar sem sjást í furuþráðormum virðast tengjast náið ferli metan-völdum dauða. Smásjárskoðun á mismunandi tímum sýndi að risastór safabólur mynduðust eftir 20 klst. útsetningu fyrir 5-joðindóli (0,1 mM). Smásjár safabólur sáust eftir 8 klst. meðferð og fjöldi þeirra jókst eftir 12 klst. Nokkrar stórar safabólur sáust eftir 14 klst. Nokkrar samrunnar safabólur voru greinilega sýnilegar eftir 12–16 klst. meðferð, sem bendir til þess að samruni safabóla sé grundvöllur metanógenísku dauðaferlisins. Eftir 20 klst. fundust nokkrar risastórar safabólur um allan orminn. Þessar athuganir eru fyrsta skýrslan um metanógenískan dauða í C. elegans.
Í ormum sem meðhöndlaðir voru með 5-joðindóli sást einnig samloðun og rof á safabólum (Mynd 5), eins og sést af beygju ormanna og losun safabóla út í umhverfið. Röskun á safabólum sást einnig í eggjaskurnarhimnu, sem L2 varðveitir venjulega óskemmda við klak (Viðbótarmynd S2). Þessar athuganir styðja þátttöku vökvasöfnunar og osmostýringarbilunar, sem og afturkræfra frumuskaða (RCI), í ferli safabólamyndunar og fæturmyndunar (Mynd 5).
Við settum fram tilgátu um hlutverk joðs í myndun safabóla sem fram kom og rannsökuðum þráðormaeiturvirkni natríumjoðíðs (NaI) og kalíumjoðíðs (KI). Hins vegar höfðu þau, við styrkleika (0,1, 0,5 eða 1 mM), hvorki áhrif á lifun þráðormanna né myndun safabóla (viðbótarmynd S5), þó að 1 mM KI hefði væg þráðormaeiturvirkni. Hins vegar olli 7-joðindól (1 eða 2 mM), líkt og 5-joðindól, mörgum safabólum og byggingaraflögun (viðbótarmynd S6). Þessi tvö joðindól sýndu svipaða svipgerðareiginleika í furuþráðormum, en NaI og KI gerðu það ekki. Athyglisvert er að indól olli ekki myndun safabóla í B. xylophilus við þá styrkleika sem prófaður var (gögn ekki sýnd). Þannig staðfestu niðurstöðurnar að indól-joð flókið ber ábyrgð á safabólumyndun og efnaskiptum B. xylophilus.
Meðal indóla sem prófuð voru til að draga úr nematíudrepandi virkni hafði 5-joðindól hæsta rennslisstuðulinn, -5,89 kcal/mól, þar á eftir komu 7-joðindól (-4,48 kcal/mól), 4-flúorindól (-4,33) og indól (-4,03) (Mynd 6). Sterk vetnistengi 5-joðindóls við leucín 218 stöðugar bindingu þess, en allar aðrar indólafleiður bindast seríni 260 í gegnum vetnistengi í hliðarkeðjunni. Meðal annarra joðindóla sem hafa verið líkanuð hefur 2-joðindól bindingargildi upp á -5,248 kcal/mól, sem er vegna aðalvetnistengis þess við leucín 218. Aðrar þekktar bindingar eru meðal annars 3-joðindól (-4,3 kcal/mól), 4-joðindól (-4,0 kcal/mól) og 6-flúorindól (-2,6 kcal/mól) (viðbótarmynd S8). Flest halógenuð indól og indól sjálft, fyrir utan 5-joðindól og 2-joðindól, mynda tengi við serín 260. Sú staðreynd að vetnistengi við leucín 218 gefur til kynna skilvirka viðtaka-lígand bindingu, eins og sést fyrir ivermektín (viðbótarmynd S7), staðfestir að 5-joðindól og 2-joðindól, eins og ivermektín, bindast fast við virka staðinn á GluCL viðtakanum í gegnum leucín 218 (mynd 6 og viðbótarmynd S8). Við leggjum til að þessi binding sé nauðsynleg til að viðhalda opnum porabyggingu GluCL fléttunnar og að með því að bindast fast við virka staðinn á GluCL viðtakanum haldi 5-joðindól, 2-joðindól, avermektín og ivermektín þannig jónaganginum opnum og leyfi vökvaupptöku.
Sameindatenging indóls og halógenaðs indóls við GluCL. Bindingarstefnur (A) indóls, (B) 4-flúorindóls, (C) 7-joðindóls og (D) 5-joðindóls líganda við virka staðinn á GluCL. Próteinið er táknað með borða og vetnistengi hryggjarins eru sýnd með gulum punktalínum. (A′), (B′), (C′) og (D′) sýna víxlverkun samsvarandi líganda við umlykjandi amínósýruleifar og vetnistengi hliðarkeðjunnar eru merkt með bleikum punktaörvum.
Tilraunir voru gerðar til að meta eituráhrif 5-joðindóls á spírun hvítkáls- og radísufræja. 5-joðindól (0,05 eða 0,1 mM) eða avermektín (10 μg/ml) höfðu lítil sem engin áhrif á upphafsspírun og spírun plöntunnar (Mynd 7). Þar að auki fannst enginn marktækur munur á spírunarhraða ómeðhöndlaðs samanburðar og fræja sem meðhöndluð voru með 5-joðindóli eða avermektíni. Áhrifin á lengingu höfuðrótar og fjölda myndaðra hliðarróta voru óveruleg, þó að 1 mM (10 sinnum virkur styrkur) af 5-joðindóli hafi seinkað örlítið þroska hliðarróta. Þessar niðurstöður benda til þess að 5-joðindól sé ekki eitrað fyrir plöntufrumur og trufli ekki þroskaferli plantna við þá styrkleika sem rannsakaður var.
Áhrif 5-joðindóls á spírun fræja. Spírun, spírun og hliðarrætur fræja af tegundinni B. oleracea og R. raphanistrum á Murashige og Skoog agarmiðli með eða án avermektíns eða 5-joðindóls. Spírun var skráð eftir 3 daga ræktun við 22°C.
Þessi rannsókn greinir frá nokkrum tilfellum þar sem indólar hafa drepið þráðorma. Mikilvægt er að hafa í huga að þetta er fyrsta skýrslan um metýleringu af völdum joðindóls (ferli sem orsakast af uppsöfnun lítilla safabóla sem smám saman sameinast í risastórar safabólur, sem að lokum leiðir til himnusprungu og dauða) í furunálum, þar sem joðindól sýnir verulega þráðorðudrepandi eiginleika svipaða og afermektín, sem er hefðbundið þráðorðudrepandi efni.
Áður hefur verið greint frá því að indól gegni fjölmörgum boðefnahlutverkum í dreifkjörnungum og heilkjörnungum, þar á meðal hömlun/myndun líffilmu, lifun baktería og sjúkdómsvaldandi áhrifum19,32,33,34. Nýlega hafa hugsanleg meðferðaráhrif halógenaðra indóla, indólalkalóíða og hálftilbúinna indólafleiða vakið mikinn áhuga í rannsóknum35,36,37. Til dæmis hefur verið sýnt fram á að halógenuð indól drepa þrálátar Escherichia coli og Staphylococcus aureus frumur37. Að auki er vísindalegt áhugamál að rannsaka virkni halógenaðra indóla gegn öðrum tegundum, ættkvíslum og konungsríkjum, og þessi rannsókn er skref í átt að því markmiði.
Hér leggjum við til aðferð til að valda dauða af völdum 5-joðindóls í C. elegans, byggt á afturkræfum frumuskaða (RCI) og metýleringu (myndir 4C og 5). Bjúgmyndandi breytingar eins og þroti og hrörnun í frumubólum eru vísbendingar um RCI og metýleringu, sem birtast sem risavaxnar frumubólur í umfryminu48,49. RCI truflar orkuframleiðslu með því að draga úr ATP-framleiðslu, valda bilun í ATPasa dælunni eða raska frumuhimnum og valda hraðri innstreymi Na+, Ca2+ og vatns50,51,52. Innanfrumubólur myndast í dýrafrumum vegna vökvasöfnunar í umfryminu vegna innstreymis Ca2+ og vatns53. Athyglisvert er að þessi frumuskemmdaferli er afturkræft ef skaðinn er tímabundinn og frumurnar byrja að framleiða ATP í ákveðinn tíma, en ef skaðinn varir eða versnar, deyja frumurnar.54 Athuganir okkar sýna að þráðormar sem meðhöndlaðir eru með 5-joðindóli geta ekki endurheimt eðlilega lífmyndun eftir að hafa orðið fyrir streituvaldandi aðstæðum.
Metýleringarsvipgerðin sem 5-joðindól veldur í B. xylophilus gæti stafað af nærveru joðs og sameindadreifingu þess, þar sem 7-joðindól hafði minni hamlandi áhrif á B. xylophilus en 5-joðindól (Tafla 1 og viðbótarmynd S6). Þessar niðurstöður eru að hluta til í samræmi við rannsóknir Maltese o.fl. (2014), sem greindu frá því að flutningur pýridýl köfnunarefnishluta í indóli frá para- til meta-stöðu afnam safabólumyndun, vaxtarhömlun og frumudrepandi áhrif í U251 frumum, sem bendir til þess að víxlverkun sameindarinnar við ákveðinn virkan stað í próteininu sé mikilvæg27,44,45. Víxlverkunin milli indóls eða halógenaðra indóla og GluCL viðtaka sem fram komu í þessari rannsókn styður einnig þessa hugmynd, þar sem 5- og 2-joðindól reyndust bindast GluCL viðtökum sterkar en hin indólin sem skoðuð voru (Mynd 6 og viðbótarmynd S8). Joðið í annarri eða fimmtu stöðu indólsins reyndist bindast leucíni 218 á GluCL viðtakanum í gegnum vetnistengi í hryggjarliðnum, en önnur halógenuð indól og indól sjálft mynda veik hliðarkeðjuvetnistengi með seríni 260 (Mynd 6). Við gerum því ráð fyrir að staðsetning halógensins gegni mikilvægu hlutverki í örvun safabóluhrörnunar, en sterk binding 5-joðindóls haldi jónagangi opnum, sem gerir kleift að streyma hratt inn í vökva og rofi safabólu. Hins vegar er nákvæmur verkunarháttur 5-joðindóls enn óákveðinn.
Áður en 5-joðindól er notað í reynd þarf að greina eituráhrif þess á plöntur. Tilraunir okkar með spírun fræja sýndu að 5-joðindól hafði engin neikvæð áhrif á spírun fræja eða síðari þroskaferli við þá styrkleika sem rannsakaður var (Mynd 7). Þessi rannsókn veitir því grunn að notkun 5-joðindóls í vistfræðilegu umhverfi til að stjórna skaðsemi furutrjáa á furutré.
Fyrri skýrslur hafa sýnt fram á að meðferð byggð á indóli er möguleg leið til að takast á við vandamálið varðandi sýklalyfjaónæmi og framgang krabbameins55. Þar að auki hafa indól bakteríudrepandi, krabbameinshemjandi, andoxunarefnishemjandi, bólgueyðandi, sykursýkishemjandi, veiruhemjandi, frumufjölgunarhemjandi og berklahemjandi virkni og gætu þjónað sem efnilegur grunnur fyrir lyfjaþróun56,57. Þessi rannsókn bendir í fyrsta skipti til mögulegrar notkunar joðs sem sníkjudýralyfs og ormalyfs.
Avermektín var uppgötvað fyrir þremur áratugum og vann Nóbelsverðlaunin árið 2015, og notkun þess sem ormalyf er enn í gangi. Hins vegar, vegna hraðrar þróunar ónæmis gegn avermektínum í þráðormum og skordýrum, er þörf á annarri, ódýrri og umhverfisvænni aðferð til að stjórna furutrjámsýkingu. Þessi rannsókn greinir einnig frá því hvernig 5-joðindól drepur furutrjár og að 5-joðindól hefur litla eituráhrif á plöntufrumur, sem opnar góða möguleika á framtíðarnotkun þess í viðskiptalegum tilgangi.
Allar tilraunir voru samþykktar af siðanefnd Yeungnam-háskóla í Gyeongsan í Kóreu og aðferðirnar voru framkvæmdar í samræmi við leiðbeiningar siðanefndar Yeungnam-háskóla.
Tilraunir með eggjaræktun voru gerðar með viðurkenndum aðferðum43. Til að meta klakhraða (HR) voru eins dags gamlir fullorðnir þráðormar (um það bil 100 kvenkyns og 100 karlkyns) fluttir í Petri-skálar sem innihéldu sveppinn og leyfðir að vaxa í 24 klst. Eggin voru síðan einangruð og meðhöndluð með 5-joðindóli (0,05 mM og 0,1 mM) eða avermektíni (10 μg/ml) sem sviflausn í dauðhreinsuðu eimuðu vatni. Þessar sviflausnir (500 μl; um það bil 100 egg) voru fluttar í holur á 24 holum vefjaræktarplötu og ræktaðar við 22°C. L2 talningar voru gerðar eftir 24 klst. ræktun en voru taldar dauðar ef frumurnar hreyfðust ekki þegar þær voru örvaðar með fínum platínuvír. Þessi tilraun var framkvæmd í tveimur áföngum, hvoru með sex endurtekningum. Gögnin úr báðum tilraununum voru sameinuð og kynnt. Hlutfall HR er reiknað út á eftirfarandi hátt:
Lirfudauði var metinn með áður þróuðum aðferðum. Egg þráðorma voru safnað og fósturvísar samstilltir með klekkingu í dauðhreinsuðu eimuðu vatni til að mynda lirfur á L2 stigi. Samstilltar lirfur (um það bil 500 þráðormar) voru meðhöndlaðar með 5-joðindóli (0,05 mM og 0,1 mM) eða avermektíni (10 μg/ml) og alin upp á B. cinerea Petri plötum. Eftir 48 klst. ræktun við 22°C voru þráðormar safnað í dauðhreinsuðu eimuðu vatni og skoðaðir fyrir tilvist L2, L3 og L4 stiga. Tilvist L3 og L4 stiga benti til umbreytingar lirfa, en tilvist L2 stigs benti til engra umbreytinga. Myndir voru teknar með iRiS™ Digital Cell Imaging System. Þessi tilraun var framkvæmd í tveimur stigum, hvort með sex endurtekningum. Gögnin úr báðum tilraunum voru sameinuð og kynnt.
Eituráhrif 5-joðindóls og avermektíns á fræ voru metin með spírunarprófum á Murashige og Skoog agarplötum.62 Fræ af B. oleracea og R. raphanistrum voru fyrst lögð í bleyti í dauðhreinsuðu eimuðu vatni í einn dag, þvegin með 1 ml af 100% etanóli, dauðhreinsuð með 1 ml af 50% hefðbundnu bleikiefni (3% natríumhýpóklórít) í 15 mínútur og þvegin fimm sinnum með 1 ml af dauðhreinsuðu vatni. Sótthreinsuðu fræin voru síðan þrýst á spírunaragarplötur sem innihéldu 0,86 g/l (0,2X) Murashige og Skoog miðil og 0,7% bakteríuagar með eða án 5-joðindóls eða avermektíns. Plöturnar voru síðan ræktaðar við 22°C og myndir voru teknar eftir 3 daga ræktun. Þessi tilraun var framkvæmd í tveimur áföngum, sem hvor um sig hafði sex endurtekningar.
Birtingartími: 26. febrúar 2025