Furuþráðormurinn er sóttkví, farandsníkjudýr sem vitað er að veldur miklu efnahagslegu tjóni í vistkerfum furuskóga. Í þessari rannsókn er farið yfir þráðorkuvirkni halógenaðra indóla gegn furuþormum og verkunarmáta þeirra. Þráðormadrepandi virkni 5-joðindóls og avermektíns (jákvæð stjórn) gegn furuþráðormum var svipuð og mikil við lágan styrk (10 μg/ml). 5-joðindól minnkaði frjósemi, æxlunarvirkni, fósturvísa og lirfudauða og hreyfihegðun. Sameindasamskipti bindla við hryggleysingjasértæka glútamatstýrða klóríðgöngviðtaka styðja þá hugmynd að 5-joðindól, eins og avermektín, binst þétt við virka staðinn viðtaka. 5-Jódóindól olli einnig ýmsum svipgerða aflögun í þráðormum, þar á meðal óeðlilegt hrun/samdrátt líffæra og aukna loftræstingu. Þessar niðurstöður benda til þess að vacuoles geti gegnt hlutverki í þráðormametýlerunarmiðluðum dauða. Mikilvægt er að 5-joðindól var ekki eitrað fyrir báðar plöntutegundirnar (kál og radísa). Þannig sýnir þessi rannsókn að notkun joðindóls við umhverfisaðstæður getur stjórnað skemmdum á furu.
Furuviðarþráðormur (Bursaphelenchus xylophilus) tilheyrir furuskógarþormum (PWN), farandþráðormum sem vitað er að valda alvarlegum vistfræðilegum skaða á vistkerfum furuskóga1. Furusýkingarsjúkdómur (PWD) af völdum furuviðarþormunnar er að verða alvarlegt vandamál í nokkrum heimsálfum, þar á meðal Asíu og Evrópu, og í Norður-Ameríku eyðileggur þráðormurinn innfluttar furutegundir1,2. Fækkun furutrjáa er stórt efnahagslegt vandamál og horfur á útbreiðslu þess á heimsvísu eru áhyggjuefni3. Algengast er að þráðormurinn ráðist á eftirfarandi furutegundir: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii og Pinus radiata4. Furuþráðormur er alvarlegur sjúkdómur sem getur drepið furutré innan vikna eða mánaða frá sýkingu. Auk þess eru uppkomur furuþráðorma algengar í ýmsum vistkerfum og því hafa þrálátar smitkeðjur verið komnar á fót1.
Bursaphelenchus xylophilus er plöntu-sníkjuþráðormur í sóttkví sem tilheyrir yfirættinni Aphelenchoidea og klæði 102.5. Þráðormurinn nærist á sveppum og fjölgar sér í viðarvef furutrjáa og þróast í fjögur mismunandi lirfustig: L1, L2, L3, L4 og fullorðinn einstakling1,6. Við aðstæður þar sem skortur er á fæðu fer furuþormurinn yfir á sérhæft lirfustig – dauer, sem sníklar ferju sína – furuberkjabjölluna (Monochamus alternatus) og færist yfir á heilbrigð furutrjáa. Hjá heilbrigðum hýslum flytjast þráðormar hratt í gegnum plöntuvef og nærast á parenchymatous frumum, sem leiðir til fjölda ofnæmisviðbragða, furuþornunar og dauða innan árs eftir sýkingu1,7,8.
Líffræðileg eftirlit með þráðormum úr furu hefur lengi verið áskorun, með sóttkví aðgerðir aftur til 20. aldar. Núverandi aðferðir til að stjórna furuþráðormum fela fyrst og fremst í sér efnafræðilega meðhöndlun, þar með talið viðarfræsingu og ígræðslu þráðorma í trjástofna. Algengustu þráðormur eru avermectin og avermectin benzoat, sem tilheyra avermectin fjölskyldunni. Þessi dýru efni eru mjög áhrifarík gegn mörgum þráðormategundum og eru talin umhverfisvæn9. Hins vegar er búist við að endurtekin notkun þessara þráðorma muni skapa valþrýsting sem mun næstum örugglega leiða til uppkomu ónæmra furuþráðorma, eins og sýnt hefur verið fram á fyrir nokkra skordýra meindýra, eins og Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella og þráðormurnar Trichostrongylus colubriformis og Ostertagia circu, sem hafa þróað með sér þol gegn sýklalyfjum. avermektín10,11,12. Þess vegna þarf að rannsaka ónæmismynstur reglulega og skima þráðormalyf stöðugt til að finna aðrar, hagkvæmar og umhverfisvænar ráðstafanir til að stjórna PVD. Á undanförnum áratugum hefur fjöldi höfunda lagt til að plöntuþykkni, ilmkjarnaolíur og rokgjörn efni séu notuð sem þráðormavarnarefni13,14,15,16.
Nýlega sýndum við fram á þráðadrepandi virkni indóls, millifrumu- og boðsameindar milli fruma, í Caenorhabditis elegans 17 . Indól er útbreitt innanfrumumerki í örveruvistfræði, sem stjórnar fjölmörgum aðgerðum sem hafa áhrif á lífeðlisfræði örvera, grómyndun, plasmíðstöðugleika, lyfjaþol, myndun líffilma og meinvirkni 18, 19 . Virkni indóls og afleiða þess gegn öðrum sjúkdómsvaldandi þráðormum hefur ekki verið rannsökuð. Í þessari rannsókn könnuðum við þráðorkuvirkni 34 indóla gegn furuþráðormum og útskýrðum verkunarmáta öflugasta 5-joðindólsins með því að nota smásjármyndatöku, tímatökuljósmyndun og sameindatengingartilraunir, og metum eituráhrif þess á plöntur með því að nota fræspírunarpróf.
Áður hefur verið greint frá því að hár styrkur (>1,0 mM) af indóli hafi þráðormadrepandi áhrif á þráðorma17. Eftir meðferð á B. xylophilus (blanduðum lífsstigum) með indóli eða 33 mismunandi indólafleiðum við 1 mM, var dánartíðni B. xylophilus mæld með því að telja lifandi og dauða þráðorma í samanburðar- og meðferðarhópnum. Fimm indól sýndu marktæka þráðorkudrepandi virkni; lifun ómeðhöndlaðs samanburðarhóps var 95 ± 7% eftir 24 klst. Af 34 indólum sem prófuð voru ollu 5-joðindól og 4-flúorindól við 1 mM 100% dánartíðni, en 5,6-díflúorindigó, metýlindól-7-karboxýlat og 7-joðindól ollu um það bil 50% dánartíðni (tafla 1).
Áhrif 5-joðindóls á vacuole myndun og umbrot furu viðar þráðorma. (A) Áhrif avermektíns og 5-joðindóls á fullorðna karlkyns þráðorma, (B) L1 stigs þráðormaegg og (C) efnaskipti B. xylophilus, (i) vacuoles sáust ekki eftir 0 klst., meðferð leiddi til (ii) vacuoles, (iii) uppsöfnun margra vacuoles, (iv) fusion vacuoles, (iv) fusion of vacuoles, (iv) vacuoles of vacuoles. lofttæmi og (vi) myndun risastórra lofttæma. Rauðar örvar gefa til kynna bólga í lofttæmum, bláar örvar gefa til kynna samruna lofttæma og svartar örvar gefa til kynna risastór lofttæmi. Skalastrik = 50 μm.
Að auki lýsti þessi rannsókn einnig raðferli dauða af völdum metans í furuþormum (Mynd 4C). Metanógendauði er tegund frumudauða sem ekki er frumudauði sem tengist uppsöfnun áberandi umfrymisvakuóla27. Formfræðilegir gallar sem sjást í furuþráðormum virðast vera nátengdir aðferðum dauða af völdum metans. Smásjárrannsókn á mismunandi tímum sýndi að risastór lofttæmi mynduðust eftir 20 klst útsetningu fyrir 5-joðindóli (0,1 mM). Smásæjar lofttæmingar sáust eftir 8 klst. meðferð og fjöldi þeirra jókst eftir 12 klst. Nokkrar stórar lofttæmingar komu fram eftir 14 klst. Nokkrar samrunnar lofttæmingar voru greinilega sýnilegar eftir 12–16 klst. meðferð, sem gefur til kynna að samruni lofttæmis sé grundvöllur metanógendauðans. Eftir 20 klukkustundir fundust nokkrar risastórar lofttæmar um allan orminn. Þessar athuganir tákna fyrstu skýrsluna um metuosis í C. elegans.
Hjá 5-joðindólmeðhöndluðum ormum sást einnig samsöfnun og rof í lofttæmi (mynd 5), eins og sést af beygingu orma og losun lofttæma út í umhverfið. Truflun á lofttæmi kom einnig fram í eggjaskelhimnu, sem er venjulega varðveitt ósnortinn af L2 við útungun (aukamynd S2). Þessar athuganir styðja þátttöku vökvasöfnunar og osmóstýringarbilunar, sem og afturkræfs frumuskaða (RCI), í ferli lofttæmamyndunar og æðamyndunar (mynd 5).
Með tilgátu um hlutverk joðs í þeirri lofttæmumyndun sem sést, könnuðum við þráðorkuvirkni natríumjoðíðs (NaI) og kalíumjoðíðs (KI). Hins vegar, við styrk (0,1, 0,5 eða 1 mM), höfðu þeir hvorki áhrif á lifun þráðorma né myndun loftrásar (viðbótarmynd S5), þó að 1 mM KI hafi lítilsháttar þráðorkueyðandi áhrif. Á hinn bóginn, 7-joðindól (1 eða 2 mM), eins og 5-joðindól, framkallaði margar lofttæmingar og byggingar aflögun (aukamynd. S6). Joðindólin tvö sýndu svipuð svipgerðareiginleika í furuþráðormum, en NaI og KI ekki. Athyglisvert er að indól olli ekki vakúólmyndun í B. xylophilus við styrkleikann sem var prófaður (gögn ekki sýnd). Þannig staðfestu niðurstöðurnar að indól-joð flókið er ábyrgt fyrir lofttæmingu og umbrotum B. xylophilus.
Meðal indóla sem prófuð voru með tilliti til þráðormadrepandi virkni var 5-joðindól með hæsta sleifastuðulinn upp á -5,89 kcal/mól, þar á eftir 7-joðindól (-4,48 kkal/mól), 4-flúorindól (-4,33) og indól (-4,03) (mynd 6). Sterk hryggjartengi 5-joðindóls við leucín 218 kemur stöðugleika á bindingu þess, en allar aðrar indólafleiður bindast seríni 260 í gegnum hliðarvetnistengi. Meðal annarra líkangerðra joðindóla hefur 2-joðindól bindigildi upp á -5,248 kkal/mól, sem er vegna aðalvetnistengis þess við leusín 218. Aðrar þekktar bindingar eru 3-joðindól (-4,3 kkal/mól), 4-joðindól (-4,0 kkal/mól) og 6-6-flúorindól (s-2mól.) mynd S8). Flest halógenað indól og indól sjálft, að undanskildum 5-joðindóli og 2-joðindóli, mynda tengi við serín 260. Sú staðreynd að vetnisbinding við leusín 218 er vísbending um skilvirka bindingu viðtaka, eins og sést fyrir ívermektín (viðbótarmynd. S7-íóindól eins og 5-íóindól og 5-íóindól, eins og ioindól og 5-ioindól). ivermektín, bindast þétt við virka stað GluCL viðtakans í gegnum leucine 218 (mynd 6 og viðbótarmynd S8). Við leggjum til að þessi binding sé nauðsynleg til að viðhalda opinni svitaholubyggingu GluCL flóksins og að með því að bindast þétt við virka stað GluCL viðtakans, 5-joðindól, 2-joðindól, avermektín og ivermektín, haldi þannig jónagönginni opinni og leyfir vökvaupptöku.
Sameindatenging indóls og halógenaðs indóls við GluCL. Bindandi stefnur (A) indól, (B) 4-flúorindól, (C) 7-joðindól og (D) 5-joðindól bindla við virka staðinn GluCL. Próteinið er táknað með borði og vetnistengi hryggjarins eru sýnd sem gular punktalínur. (A′), (B′), (C′) og (D′) sýna víxlverkun samsvarandi bindla við nærliggjandi amínósýruleifar, og hliðarkeðjuvetnistengin eru auðkennd með bleikum doppóttum örvum.
Gerðar voru tilraunir til að meta eituráhrif 5-joðindóls á spírun kál- og radísufræja. 5-joðindól (0,05 eða 0,1 mM) eða avermektín (10 μg/mL) höfðu lítil sem engin áhrif á upphafsspírun og uppkomu plöntur (Mynd 7). Að auki fannst ekki marktækur munur á spírunarhraða ómeðhöndlaðra viðmiðunarhópa og fræa sem voru meðhöndluð með 5-joðindóli eða avermektíni. Áhrif á lenging rótarrótar og fjölda hliðarróta sem mynduðust voru óveruleg, þó að 1 mM (10 sinnum virkur styrkur þess) af 5-joðindóli seinkaði lítillega þróun hliðarróta. Þessar niðurstöður benda til þess að 5-joðindól sé ekki eitrað fyrir plöntufrumum og truflar ekki þroskaferla plantna við þann styrk sem rannsakaður var.
Áhrif 5-joðindóls á spírun fræja. Spírun, spíra og hliðarrót B. oleracea og R. raphanistrum fræa á Murashige og Skoog agar miðli með eða án avermektíns eða 5-joðindóls. Spírun var skráð eftir 3 daga ræktun við 22°C.
Þessi rannsókn greinir frá nokkrum tilfellum af þráðormadrepi með indólum. Mikilvægt er að þetta er fyrsta skýrslan um joðindól sem framkallar metýleringu (ferli sem orsakast af uppsöfnun lítilla lofttæma sem smám saman renna saman í risastórar lofttæmar, sem að lokum leiða til himnurofs og dauða) í furu nálum, þar sem joðindól hefur umtalsverða þráðormadrepandi eiginleika svipaða þeim sem er í verslunarþormaeyði.
Áður hefur verið greint frá því að indól gegni margvíslegum boðunaraðgerðum í dreifkjörnungum og heilkjörnungum, þar með talið hömlun/myndun líffilmu, lifun baktería og sjúkdómsvaldandi áhrif19,32,33,34. Nýlega hafa hugsanleg lækningaleg áhrif halógenaðra indóla, indólalkalóíða og hálftilbúna indólafleiða vakið mikla rannsóknaráhuga35,36,37. Til dæmis hefur verið sýnt fram á að halógen indól drepur þrálátar Escherichia coli og Staphylococcus aureus frumur37. Að auki er vísindalegt áhugamál að rannsaka virkni halógenaðra indóla gegn öðrum tegundum, ættkvíslum og konungsríkjum og er þessi rannsókn skref í átt að því markmiði.
Hér leggjum við til kerfi fyrir 5-joðindól af völdum dauða í C. elegans byggt á afturkræfum frumuskaða (RCI) og metýleringu (myndir 4C og 5). Bjúgbreytingar eins og þroti og hrörnun í lofttæmi eru vísbendingar um RCI og metýleringu, sem birtist sem risastór lofttæmi í umfrymi48,49. RCI truflar orkuframleiðslu með því að draga úr ATP framleiðslu, veldur bilun í ATPase dælunni eða truflar frumuhimnur og veldur hröðu innstreymi Na+, Ca2+ og vatns50,51,52. Intracytoplasmic vacuoles myndast í dýrafrumum vegna vökvasöfnunar í umfryminu vegna innstreymis Ca2+ og vatns53. Athyglisvert er að þessi gangur frumuskemmda gengur til baka ef skaðinn er tímabundinn og frumurnar byrja að framleiða ATP í ákveðinn tíma, en ef skaðinn er viðvarandi eða versnar þá deyja frumurnar.54 Athuganir okkar sýna að þráðormar sem eru meðhöndlaðir með 5-joðindóli geta ekki endurheimt eðlilega lífmyndun eftir útsetningu fyrir streituskilyrðum.
Metýleringarsvipgerðin sem 5-joðindól framkallar í B. xylophilus gæti stafað af nærveru joðs og sameindadreifingu þess, þar sem 7-joðindól hafði minni hamlandi áhrif á B. xylophilus en 5-joðindól (tafla 1 og viðbótarmynd S6). Þessar niðurstöður eru að hluta í samræmi við rannsóknir Maltese o.fl. (2014), sem greindi frá því að flutningur á pýridýl köfnunarefnishlutanum í indóli úr para- í meta-stöðu aflétti loftræstingu, vaxtarhömlun og frumueiturhrifum í U251 frumum, sem bendir til þess að samspil sameindarinnar við tiltekinn virkan stað í próteininu sé mikilvæg27,44,45. Samskiptin milli indóls eða halógenaðra indóla og GluCL viðtaka sem komu fram í þessari rannsókn styðja einnig þessa hugmynd, þar sem 5- og 2-joðindól reyndust bindast GluCL viðtökum sterkari en önnur indól sem skoðuð voru (Mynd 6 og viðbótarmynd S8). Í ljós kom að joðið í annarri eða fimmtu stöðu indólsins binst leusíni 218 í GluCL viðtakanum með vetnistengi í hryggjarliðinu, en önnur halógenuð indól og indól sjálft mynda veik hliðarkeðjuvetnistengi við serín 260 (mynd 6). Við getum því velt því fyrir okkur að staðsetning halógensins gegni mikilvægu hlutverki í framkalli lofttæmdarhrörnunar, en þétt binding 5-joðindóls heldur jónarásinni opinni og leyfir þar með hröðu innstreymi vökva og rof í lofttæmi. Hins vegar á eftir að ákvarða nákvæman verkunarmáta 5-joðindóls.
Áður en 5-joðindól er notað í raun, ætti að greina eituráhrif þess á plöntur. Fræspírunartilraunir okkar sýndu að 5-joðindól hafði engin neikvæð áhrif á spírun fræs eða síðari þróunarferli við þann styrk sem rannsakaður var (Mynd 7). Þannig gefur þessi rannsókn grundvöll fyrir notkun 5-joðindóls í vistfræðilegu umhverfi til að stjórna skaðsemi furuþráðorma fyrir furutrjám.
Fyrri skýrslur hafa sýnt fram á að meðferð sem byggir á indóli er hugsanleg nálgun til að takast á við vandamálið með sýklalyfjaónæmi og krabbameinsframvindu55. Að auki hafa indól bakteríudrepandi, krabbameinslyf, andoxunarefni, bólgueyðandi, sykursýkislyf, veirueyðandi, fjölgunar- og berklavirkni og geta þjónað sem vænlegur grunnur fyrir þróun lyfja56,57. Þessi rannsókn bendir í fyrsta skipti til hugsanlegrar notkunar joðs sem sníkjudýra- og ormalyfs.
Avermectin var uppgötvað fyrir þremur áratugum og hlaut Nóbelsverðlaunin árið 2015 og notkun þess sem ormalyf er enn í gangi. Vegna hraðrar þróunar ónæmis fyrir avermektínum í þráðormum og skordýraeyðingum er hins vegar þörf á annarri, ódýrri og umhverfisvænni aðferð til að hafa hemil á PWN sýkingu í furutrjám. Þessi rannsókn greinir einnig frá því hvernig 5-joðindól drepur furuþráðorma og að 5-joðindól hefur litla eiturhrif á plöntufrumur, sem opnar góðar horfur fyrir framtíðarviðskiptanotkun þess.
Allar tilraunir voru samþykktar af siðanefnd Yeungnam háskólans, Gyeongsan, Kóreu, og voru aðferðirnar framkvæmdar í samræmi við leiðbeiningar siðanefndar Yeungnam háskólans.
Eggræktunartilraunir voru gerðar með því að nota viðurkenndar aðferðir43. Til að meta útungunarhraða (HR) voru 1 dags gamlir fullorðnir þráðormar (u.þ.b. 100 kvendýr og 100 karldýr) fluttir yfir í Petri diska sem innihéldu sveppinn og látnir vaxa í 24 klst. Egg voru síðan einangruð og meðhöndluð með 5-joðindóli (0,05 mM og 0,1 mM) eða avermektíni (10 μg/ml) sem sviflausn í dauðhreinsuðu eimuðu vatni. Þessar sviflausnir (500 μl; um það bil 100 egg) voru fluttar í brunna 24-brunna vefjaræktunarplötu og ræktaðar við 22°C. L2 talningar voru gerðar eftir 24 klst. ræktun en voru taldar dauðar ef frumurnar hreyfðust ekki þegar þær voru örvaðar með fínum platínuvír. Þessi tilraun var gerð í tveimur áföngum, hvert með sex endurtekningum. Gögnin úr báðum tilraununum voru sameinuð og kynnt. Hlutfall HR er reiknað sem hér segir:
Lirfudauði var metinn með áður þróuðum aðferðum. Þráðormaeggjum var safnað og fósturvísar voru samstilltir með því að klekjast út í dauðhreinsuðu eimuðu vatni til að mynda L2 stigs lirfur. Samstilltar lirfur (um það bil 500 þráðormar) voru meðhöndlaðar með 5-joðindóli (0,05 mM og 0,1 mM) eða avermektíni (10 μg/ml) og ræktaðar á B. cinerea Petri plötum. Eftir 48 klst ræktun við 22 °C var þráðormum safnað í dauðhreinsuðu eimuðu vatni og skoðaðir með tilliti til tilvistar L2, L3 og L4 stigs. Tilvist L3 og L4 stigs benti til umbreytingar lirfa, en tilvist L2 stigs gaf til kynna enga umbreytingu. Myndir voru teknar með iRiS™ Digital Cell Imaging System. Þessi tilraun var gerð í tveimur áföngum, hvert með sex endurtekningum. Gögnin úr báðum tilraununum voru sameinuð og kynnt.
Eiturhrif 5-joðindóls og avermektíns á fræ voru metin með því að nota spírunarpróf á Murashige og Skoog agar plötum.62 B. oleracea og R. raphanistrum fræ voru fyrst lögð í bleyti í dauðhreinsuðu eimuðu vatni í einn dag, þvegin með 1 ml 100% etanóls í sölu, sæfð með 30% 100% etanóli, dauðhreinsuð með 50% sodium ml etanóli. 15 mín, og þvegið fimm sinnum með 1 ml dauðhreinsuðu vatni. Sótthreinsuðu fræinu var síðan pressað á spírunaragarplötur sem innihéldu 0,86 g/l (0,2X) Murashige og Skoog miðil og 0,7% bakteríuagar með eða án 5-joðindóls eða avermektíns. Plöturnar voru síðan ræktaðar við 22°C og myndir teknar eftir 3 daga ræktun. Þessi tilraun var gerð í tveimur áföngum, sem hvert um sig hafði sex endurtekningar.
Pósttími: 26-2-2025