Þessi rannsókn mat dánartíðni, undirdauðnartíðni og eituráhrif viðskiptalegra lyfja.sýpermetrínlyfjaformúlurnar fyrir halakörfur af tegundinni Anura. Í bráðaprófinu voru styrkleikar á bilinu 100–800 μg/L prófaðir í 96 klst. Í langtímaprófinu voru náttúrulegir styrkleikar sýpermetríns (1, 3, 6 og 20 μg/L) prófaðir fyrir dánartíðni, og síðan örkjarnapróf og kjarnafrávik í rauðum blóðkornum í 7 daga. LC50 gildi hefðbundinnar sýpermetrínblöndunnar fyrir halakörfur var 273,41 μg L−1. Í langtímaprófinu leiddi hæsti styrkurinn (20 μg L−1) til meira en 50% dánartíðni, þar sem hann drap helming prófaðra halakörfa. Örkjarnaprófið sýndi marktækar niðurstöður við 6 og 20 μg L−1 og nokkrar kjarnafrávik greindust, sem bendir til þess að hefðbundna sýpermetrínblöndunin hafi erfðaeituráhrif gegn P. gracilis. Sýpermetrín er mikil áhætta fyrir þessa tegund, sem bendir til þess að það geti valdið fjölmörgum vandamálum og haft áhrif á virkni þessa vistkerfis til skamms og langs tíma. Því má álykta að hefðbundnar cypermetrín blöndur hafi eituráhrif á P. gracilis.
Vegna sívaxandi vaxtar landbúnaðarstarfsemi og mikillar notkunar ámeindýraeyðingráðstafanir, vatnadýr eru oft útsett fyrir skordýraeitri1,2. Mengun vatnsauðlinda nálægt landbúnaðarökrum getur haft áhrif á þroska og lifun lífvera sem ekki eru markhópur, svo sem froskdýra.
Froskdýr eru sífellt mikilvægari við mat á umhverfisþáttum. Froskdýr af sama uppruna eru talin góð líffræðileg vísbending um umhverfismengun vegna einstakra eiginleika þeirra eins og flókinna lífsferla, hraðs vaxtarhraða lirfa, fæðustöðu, gegndræprar húðar10,11, háðs vatns til æxlunar12 og óvarinna eggja11,13,14. Litli vatnsfroskurinn (Physalaemus gracilis), almennt þekktur sem grátandi froskur, hefur reynst vera líffræðileg vísbending um mengun af völdum skordýraeiturs4,5,6,7,15. Tegundin finnst í kyrrstæðum vötnum, vernduðum svæðum eða svæðum með breytilegu búsvæði í Argentínu, Úrúgvæ, Paragvæ og Brasilíu1617 og er talin stöðug samkvæmt flokkun IUCN vegna víðtækrar útbreiðslu og þols gagnvart mismunandi búsvæðum18.
Greint hefur verið frá nærri banvænum áhrifum hjá froskdýrum eftir útsetningu fyrir sýpermetríni, þar á meðal atferlis-, formfræðilegum og lífefnafræðilegum breytingum hjá halakörlum23,24,25, breyttum dánartíðni og myndbreytingartíma, ensímbreytingum, minnkuðum klakárangri24,25, ofvirkni26, hömlun á kólesterasa virkni27 og breytingum á sundgetu7,28. Hins vegar eru rannsóknir á erfðaeituráhrifum sýpermetríns hjá froskdýrum takmarkaðar. Því er mikilvægt að meta næmi anúra-tegunda fyrir sýpermetríni.
Umhverfismengun hefur áhrif á eðlilegan vöxt og þroska froskdýra, en alvarlegasta skaðlega áhrifin eru erfðaskemmdir á DNA af völdum útsetningar fyrir skordýraeitri13. Greining á blóðkornaformgerð er mikilvægur líffræðilegur vísir um mengun og hugsanlega eituráhrif efnis á villtar tegundir29. Örkjarnapróf er ein algengasta aðferðin til að ákvarða erfðaeituráhrif efna í umhverfinu30. Þetta er hraðvirk, áhrifarík og ódýr aðferð sem er góð vísbending um efnamengun lífvera eins og froskdýra31,32 og getur veitt upplýsingar um útsetningu fyrir erfðaeiturefnum33.
Markmið þessarar rannsóknar var að meta eituráhrif viðskiptalegra sýpermetrínformúla á litlar vatnahalatar með því að nota örkjarnapróf og vistfræðilegt áhættumat.
Uppsafnaður dánartíðni (%) P. gracilis halakarla sem voru útsettir fyrir mismunandi styrk af hefðbundnu sýpermetríni á bráðatímabili prófunarinnar.
Uppsafnaður dánartíðni (%) P. gracilis halakarla sem voru útsettir fyrir mismunandi styrk af hefðbundnu sýpermetríni í langtímaprófi.
Há dánartíðni sem kom fram var afleiðing eituráhrifa á erfðaefni hjá froskdýrum sem voru útsett fyrir mismunandi styrk sýpermetríns (6 og 20 μg/L), eins og sést af nærveru örkjarna (MN) og kjarnafrávikum í rauðkornum. Myndun MN gefur til kynna villur í mítósu og tengist lélegri bindingu litninga við örpípla, göllum í próteinfléttum sem bera ábyrgð á upptöku og flutningi litninga, villum í litningaaðskilnaði og villum í viðgerðum á DNA-skemmdum38,39 og getur tengst oxunarálagi af völdum skordýraeiturs40,41. Aðrar frávik komu fram við alla styrki sem metnir voru. Aukin þéttni sýpermetríns jók kjarnafrávik í rauðkornum um 5% og 20% við lægstu (1 μg/L) og hæstu (20 μg/L) skammta, talið í sömu röð. Til dæmis geta breytingar á DNA tegundar haft alvarlegar afleiðingar fyrir bæði skammtíma- og langtímalifun, sem leiðir til fækkunar stofns, breyttrar æxlunarhæfni, innræktunar, taps á erfðafræðilegri fjölbreytni og breyttra flutningshraða. Allir þessir þættir geta haft áhrif á lifun og viðhald tegunda42,43. Myndun rauðkornaafbrigða getur bent til hindrunar á frumuboðefnum, sem leiðir til óeðlilegrar frumuskiptingar (tvíkjarna rauðkorna)44,45; fjölblaða kjarnar eru útskot á kjarnahimnunni með mörgum blaðum46, en önnur rauðkornaafbrigði geta tengst DNA-magnun, svo sem kjarnanýru/blöðrur47. Tilvist kjarnalausra rauðkorna getur bent til skerts súrefnisflutnings, sérstaklega í menguðu vatni48,49. Apoptosis bendir til frumudauða50.
Aðrar rannsóknir hafa einnig sýnt fram á erfðaeituráhrif sýpermetríns. Kabaña o.fl.51 sýndu fram á örkjarna- og kjarnabreytingar eins og tvíkjarna frumur og frumudauðafrumur í frumum af tegundinni Odontophrynus americanus eftir útsetningu fyrir miklum styrk sýpermetríns (5000 og 10.000 μg L−1) í 96 klst. Sýpermetrín-völd frumudauði greindust einnig í P. biligonigerus52 og Rhinella arenarum53. Þessar niðurstöður benda til þess að sýpermetrín hafi erfðaeituráhrif á fjölbreyttar vatnalífverur og að MN og ENA prófið geti verið vísbending um nær banvæn áhrif á froskdýr og geti átt við um innfæddar tegundir og villta stofna sem verða fyrir eiturefnum12.
Viðskiptalegar blöndur af sýpermetríni hafa í för með sér mikla umhverfisáhættu (bæði bráða og langvinna), þar sem HQ fara yfir mörk bandarísku umhverfisverndarstofnunarinnar (EPA)54 sem geta haft neikvæð áhrif á tegundina ef hún er til staðar í umhverfinu. Í mati á langvinnri áhættu var NOEC fyrir dánartíðni 3 μg L−1, sem staðfestir að styrkurinn sem finnst í vatni getur skapað áhættu fyrir tegundina55. Banvænn NOEC fyrir lirfur R. arenarum sem voru útsettar fyrir blöndu af endósúlfani og sýpermetríni var 500 μg L−1 eftir 168 klst.; þetta gildi lækkaði í 0,0005 μg L−1 eftir 336 klst. Höfundarnir sýna að því lengur sem útsetningin er, því lægri er styrkurinn sem er skaðlegur tegundinni. Einnig er mikilvægt að undirstrika að NOEC gildin voru hærri en hjá P. gracilis við sama útsetningartíma, sem bendir til þess að svörun tegundarinnar við sýpermetríni sé tegundarsértæk. Ennfremur, hvað varðar dánartíðni, náði CHQ gildi P. gracilis eftir útsetningu fyrir sýpermetríni 64,67, sem er hærra en viðmiðunargildið sem bandaríska Umhverfisstofnunin setti54, og CHQ gildi R. arenarum lirfna var einnig hærra en þetta gildi (CHQ > 388,00 eftir 336 klst.), sem bendir til þess að skordýraeitur sem rannsakað var, sé mikil hætta fyrir nokkrar tegundir froskdýra. Þar sem P. gracilis þarf um það bil 30 daga til að ljúka umbreytingu56, má álykta að rannsakaður styrkur sýpermetríns geti stuðlað að fækkun stofns með því að koma í veg fyrir að smitaðir einstaklingar komist á fullorðins- eða æxlunarstig á unga aldri.
Í útreiknuðu áhættumati á örkjarna og öðrum frávikum í rauðkornakjarna voru CHQ gildi á bilinu 14,92 til 97,00, sem bendir til þess að sýpermetrín hafi hugsanlega eituráhrif á erfðaefni P. gracilis, jafnvel í náttúrulegu umhverfi þess. Að teknu tilliti til dánartíðni var hámarksþéttni útlægra efnasambanda sem P. gracilis þolir 4,24 μg L−1. Hins vegar sýndi styrkur allt niður í 1 μg/L einnig eituráhrif á erfðaefni. Þessi staðreynd getur leitt til aukningar á fjölda frávika einstaklinga57 og haft áhrif á þroska og æxlun tegunda í búsvæðum þeirra, sem leiðir til fækkunar froskdýrastofna.
Skammtar skordýraeitursins sýpermetríns í verslunum sýndu mikla bráða og langvinna eituráhrif á P. gracilis. Hærri dánartíðni kom fram, líklega vegna eituráhrifa, eins og sést af tilvist örkjarna og frávika í rauðkornum, sérstaklega tenntum kjarna, flipóttum kjarna og blöðrukenndum kjarna. Að auki sýndu tegundirnar sem rannsakaðar voru aukna umhverfisáhættu, bæði bráða og langvinna. Þessar upplýsingar, ásamt fyrri rannsóknum rannsóknarhóps okkar, sýndu að jafnvel mismunandi skammtar sýpermetríns í verslunum ollu enn minnkaðri virkni asetýlkólínesterasa (AChE) og bútýrýlkólínesterasa (BChE) og oxunarálagi58, og leiddu til breytinga á sundvirkni og vansköpunar í munni59 hjá P. gracilis, sem bendir til þess að skammtar sýpermetríns í verslunum hafi mikla banvæna og nærbanvæna eituráhrif á þessa tegund. Hartmann o.fl.60 komust að því að skammtar sýpermetríns í verslunum voru eitraðastir fyrir P. gracilis og aðra tegund af sömu ættkvísl (P. cuvieri) samanborið við níu önnur skordýraeitur. Þetta bendir til þess að löglega samþykkt styrkur sýpermetríns til umhverfisverndar geti leitt til mikillar dánartíðni og langtímafækkunar í stofninum.
Frekari rannsókna er þörf til að meta eituráhrif skordýraeitursins á froskdýr, þar sem styrkurinn sem finnst í umhverfinu getur valdið mikilli dánartíðni og hugsanlega verið áhætta fyrir P. gracilis. Hvetja ætti til rannsókna á froskdýrategundir, þar sem gögn um þessar lífverur eru af skornum skammti, sérstaklega um brasilískar tegundir.
Prófun á langvinnum eituráhrifum stóð yfir í 168 klst. (7 daga) við kyrrstæðar aðstæður og nær banvænir styrkleikar voru: 1, 3, 6 og 20 μg ai L−1. Í báðum tilraununum voru 10 halar í hverjum meðferðarhópi metnir með sex endurteknum prófunum, samtals 60 halar í hverjum styrk. Meðferðin eingöngu með vatni þjónaði sem neikvæð viðmiðun. Hver tilraunauppsetning samanstóð af sæfðum glerskál með 500 ml rúmmáli og eðlisþyngd 1 halar í 50 ml af lausn. Flaskan var þakin pólýetýlenfilmu til að koma í veg fyrir uppgufun og var stöðugt loftræst.
Vatnið var efnagreint til að ákvarða styrk skordýraeiturs eftir 0, 96 og 168 klst. Samkvæmt Sabin o.fl. 68 og Martins o.fl. 69 voru greiningarnar framkvæmdar í rannsóknarstofu til greiningar á skordýraeitri (LARP) við Sambandsháskólann í Santa Maria með gasgreiningu tengdri þrefaldri fjórpóla massagreiningu (Varian líkan 1200, Palo Alto, Kaliforníu, Bandaríkjunum). Magnbundin ákvörðun skordýraeiturs í vatni er sýnd sem viðbótarefni (Tafla SM1).
Fyrir örkjarnaprófið (MNT) og kjarnafráviksprófið í rauðum blóðkornum (RNA) voru 15 halar úr hverjum meðferðarhópi greindir. Halar voru svæfðir með 5% lídókaíni (50 mg g-170) og blóðsýni voru tekin með hjartastungu með einnota heparínblönduðum sprautum. Blóðstrok var útbúið á dauðhreinsuðum smásjárglerjum, loftþurrkað, fest með 100% metanóli (4°C) í 2 mínútur og síðan litað með 10% Giemsa lausn í 15 mínútur í myrkri. Í lok ferlisins voru glerin þvegin með eimuðu vatni til að fjarlægja umfram lit og þurrkuð við stofuhita.
Að minnsta kosti 1000 rauð blóðkorn úr hverjum halakörlum voru greind með 100× smásjá með 71°C hlutföllum til að ákvarða nærveru MN og ENA. Alls voru 75.796 rauð blóðkorn úr halakörlum metin með tilliti til styrks cypermethrins og samanburðarhóps. Eituráhrif á erfðaefni voru greind samkvæmt aðferð Carrasco o.fl. og Fenech o.fl.38,72 með því að ákvarða tíðni eftirfarandi kjarnaskemmda: (1) kjarnalausar frumur: frumur án kjarna; (2) frumudauðar frumur: kjarnabrot, forritaður frumudauði; (3) tvíkjarna frumur: frumur með tveimur kjarna; (4) kjarnaknappar eða blöðrufrumur: frumur með kjarna með litlum útskotum á kjarnahimnunni, blöðrur svipaðar að stærð og örkjarnar; (5) karyolyzed frumur: frumur með aðeins útlínur kjarnans án innra efnis; (6) hakafrumur: frumur með kjarna með augljósum sprungum eða hakum í lögun sinni, einnig kallaðir nýrnalaga kjarnar; (7) lobular frumur: frumur með kjarnaútskotum sem eru stærri en áðurnefndar blöðrur; og (8) örfrumur: frumur með þéttum kjarna og minnkað umfrymi. Breytingarnar voru bornar saman við neikvæðar samanburðarniðurstöður.
Niðurstöður bráðaeituráhrifaprófa (LC50) voru greindar með GBasic hugbúnaði og TSK-Trimmed Spearman-Karber aðferðinni74. Gögn úr langvinnum prófunum voru forprófuð fyrir villuskilyrði (Shapiro-Wilks) og einsleitni dreifni (Bartlett). Niðurstöðurnar voru greindar með einhliða dreifnigreiningu (ANOVA). Próf Tukeys var notað til að bera saman gögn sín á milli og próf Dunnetts var notað til að bera saman gögn milli meðferðarhópsins og neikvæða samanburðarhópsins.
Gögn um LOEC og NOEC voru greind með Dunnett-prófi. Tölfræðilegar prófanir voru framkvæmdar með Statistica 8.0 hugbúnaði (StatSoft) með marktæknistigi 95% (p < 0,05).
Birtingartími: 13. mars 2025