Vöxtur toppsprota (SAM) er mikilvægur fyrir uppbyggingu stilksins. Plöntuhormóngibberellín(GAs) gegna lykilhlutverki í að samhæfa vöxt plantna, en hlutverk þeirra í SAM er enn illa skilið. Hér þróuðum við hlutfallslegan líffræðilegan skynjara fyrir GA-boðleiðir með því að hanna DELLA próteinið til að bæla niður nauðsynlega stjórnunarhlutverki þess í umritunarsvörun GA en varðveita niðurbrot þess við GA-greiningu. Við sýnum fram á að þessi niðurbrotsbyggði líffræðilegi skynjari skráir nákvæmlega breytingar á GA-gildum og frumuskynjun meðan á þroska stendur. Við notuðum þennan líffræðilega skynjara til að kortleggja GA-boðleiðir í SAM. Við sýnum fram á að há GA-merki eru aðallega til staðar í frumum sem eru staðsettar á milli frumna í líffærum, sem eru forverar millihnúta. Með því að nota aðferðir sem byggja á virkni-hagnaði og virkni-tap sýnum við enn fremur fram á að GA stjórnar stefnu frumuskiptingarplansins, staðfestir eðlilega frumuskipan millihnúta og stuðlar þannig að skilgreiningu millihnúta í SAM.
Sprotapunkturinn (e. sprotaminisma) inniheldur stofnfrumur sem með virkni sinni mynda hliðarlíffæri og stilkhnúta á mátbundinn og endurtekinn hátt alla ævi plöntunnar. Hver þessara endurteknu eininga, eða plöntuhnúta, inniheldur millihnúta og hliðarlíffæri við hnúta og handarkrikameristema í blaðöxlum. Vöxtur og skipulag plöntuhnúta breytist meðan á þroska stendur. Í Arabidopsis er vöxtur millihnúta bælt niður á gróðurstigi og handarkrikameristemar liggja í dvala í blaðöxlum rósettublaðanna. Á meðan á blómastiginu stendur verður SAM að blómstrandi meristema, sem myndar aflanga millihnúta og handarkrikabum, smágreinar í blaðöxlum stöngulblaða og síðar lauflaus blóm. Þó að við höfum náð verulegum árangri í að skilja þá ferla sem stjórna myndun blaða, blóma og greina, er tiltölulega lítið vitað um hvernig millihnútar myndast.
Skilningur á rúmfræðilegri og tímabundinni dreifingu GA mun hjálpa til við að skilja betur virkni þessara hormóna í mismunandi vefjum og á mismunandi þroskastigum. Myndræn framsetning á niðurbroti RGA-GFP samruna sem tjáð er undir áhrifum eigin hvata veitir mikilvægar upplýsingar um stjórnun á heildar GA magni í rótum15,16. Hins vegar er RGA tjáning mismunandi eftir vefjum17 og er stjórnað af GA18. Þannig getur mismunandi tjáning RGA hvatans leitt til flúrljómunarins sem sést með RGA-GFP og því er þessi aðferð ekki megindleg. Nýlega leiddi lífvirkt flúrljómunarmerkt GA19,20 í ljós uppsöfnun GA í rótarberki og stjórnun á frumustigi þess með GA flutningi. Nýlega sýndi GA FRET skynjarinn nlsGPS1 að GA magn tengist frumulengingu í rótum, þráðum og dökkvöxnum kímblöðrum21. Hins vegar, eins og við höfum séð, er GA styrkur ekki eini breytan sem stjórnar GA merkjavirkni, þar sem hún er háð flóknum skynjunarferlum. Hér, byggjandi á skilningi okkar á DELLA og GA boðleiðunum, greinum við frá þróun og greiningu á niðurbrotsbundnum hlutfallsmælum líffræðilegs skynjara fyrir GA boðleiðir. Til að þróa þennan megindlega líffræðilega skynjara notuðum við stökkbreytt GA-næmt RGA sem var samruna við flúrljómandi prótein og tjáð víða í vefjum, sem og GA-ónæmt flúrljómandi prótein. Við sýnum fram á að stökkbreyttir RGA prótein samrunar trufla ekki innræna GA boðleiðir þegar þær eru tjáðar víða og að þessi líffræðilegi skynjari getur magngreint boðleiðir sem stafa bæði af GA inntaki og GA merkjavinnslu með skynjunarbúnaðinum með mikilli rúmfræðilegri og tímabundinni upplausn. Við notuðum þennan líffræðilega skynjara til að kortleggja rúmfræðilega og tímabundna dreifingu GA boðleiðar og magngreina hvernig GA stjórnar frumuhegðun í SAM yfirhúð. Við sýnum fram á að GA stjórnar stefnu skiptingarplans SAM frumna sem staðsettar eru milli frumþekju líffæra og skilgreinir þannig eðlilega frumuskipan innri hnúta.
Að lokum spurðum við hvort qmRGA gæti greint frá breytingum á innrænum GA gildum með því að nota vaxandi kímblöðrur. Við sýndum áður fram á að nítrat örvar vöxt með því að auka GA myndun og þar með niðurbrot DELLA34. Þar af leiðandi sáum við að lengd kímblaðanna í pUBQ10::qmRGA plöntum sem ræktaðar voru við mikið nítratframboð (10 mM NO3−) var marktækt lengri en í plöntum sem ræktaðar voru við nítratskort (viðbótarmynd 6a). Í samræmi við vaxtarsvörunina voru GA merki hærri í kímblöðum plöntu sem ræktaðar voru við 10 mM NO3− aðstæður en í plöntum sem ræktaðar voru án nítrats (viðbótarmynd 6b, c). Þannig gerir qmRGA einnig kleift að fylgjast með breytingum á GA merkjum sem orsakast af innrænum breytingum á GA styrk.
Til að skilja hvort GA merkjavirkni sem qmRGA greinir er háð GA styrk og GA skynjun, eins og búist var við miðað við hönnun skynjarans, greindum við tjáningu þriggja GID1 viðtaka í gróður- og æxlunarvef. Í plöntum sýndi GID1-GUS tilkynningarlínan að GID1a og c voru mjög tjáð í kímblöðum (Mynd 3a–c). Að auki voru allir þrír viðtakarnir tjáðir í laufblöðum, hliðarrótarfrumum, rótaroddum (að undanskildum rótarhettu GID1b) og æðakerfinu (Mynd 3a–c). Í blóma SAM greindum við aðeins GUS merki fyrir GID1b og 1c (Viðbótarmynd 7a–c). In situ blendingur staðfesti þessi tjáningarmynstur og sýndi enn fremur að GID1c var jafnt tjáð í lágu magni í SAM, en GID1b sýndi meiri tjáningu í jaðri SAM (Viðbótarmynd 7d–l). Þýðingarsamruni pGID1b::2xmTQ2-GID1b leiddi einnig í ljós mismunandi svið GID1b tjáningar, allt frá lágri eða engri tjáningu í miðju SAM til mikillar tjáningar við líffæramörk (Viðbótarmynd 7m). Þannig eru GID1 viðtakar ekki jafnt dreifðir um og innan vefja. Í síðari tilraunum komumst við einnig að því að ofurtjáning GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) jók næmi qmRGA í kímblöðrum fyrir utanaðkomandi GA notkun (Mynd 3d, e). Aftur á móti var flúrljómun mæld með qd17mRGA í kímblöðrunni ónæm fyrir GA3 meðferð (Mynd 3f, g). Í báðum prófunum voru plöntur meðhöndlaðar með háum styrk af GA (100 μM GA3) til að meta hraða hegðun skynjarans, þar sem hæfni til að bindast GID1 viðtakanum jókst eða glataðist. Saman staðfesta þessar niðurstöður að qmRGA lífskynjarinn gegnir bæði hlutverki sem GA og GA skynjari og benda til þess að mismunandi tjáning GID1 viðtakans geti haft verulega áhrif á útgeislun skynjarans.
Dreifing GA-merkja í SAM er enn óljós til þessa. Þess vegna notuðum við plöntur sem tjá qmRGA og pCLV3::mCherry-NLS stofnfrumufréttamanninn35 til að reikna út magnbundin kort af GA-merkjavirkni með mikilli upplausn, með áherslu á L1 lagið (húðþekju; Mynd 4a, b, sjá Aðferðir og viðbótaraðferðir), þar sem L1 gegnir lykilhlutverki í að stjórna vexti SAM36. Hér veitti pCLV3::mCherry-NLS tjáning fastan rúmfræðilegan viðmiðunarpunkt til að greina rúmfræðilega og tímabundna dreifingu GA-merkjavirkni37. Þó að GA sé talið nauðsynlegt fyrir þroska hliðarlíffæra4, sáum við að GA-merki voru lág í blómafrumþekjunni (P) frá P3 stigi (Mynd 4a, b), en ungir P1 og P2 frumþekjur höfðu miðlungsmikla virkni svipaða og í miðhlutanum (Mynd 4a, b). Meiri GA boðleiðni greindist við frummörk líffærisins, byrjaði við P1/P2 (á hliðum mörkanna) og náði hámarki við P4, sem og í öllum frumum í jaðarsvæðinu sem staðsett er milli frumfrumanna (Mynd 4a, b og Viðbótarmynd 8a, b). Þessi meiri GA boðleiðni sást ekki aðeins í yfirhúðinni heldur einnig í L2 og efri L3 lögum (Viðbótarmynd 8b). Mynstur GA boðleiða sem greindust í SAM með qmRGA hélst einnig óbreytt með tímanum (Viðbótarmynd 8c–f, k). Þó að qd17mRGA smygildið hafi verið kerfisbundið niðurstýrt í SAM T3 plantna frá fimm óháðum línum sem við greindum í smáatriðum, gátum við greint flúrljómunarmynstrin sem fengust með pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP smygildinu (Viðbótarmynd 8g–j, l). Í þessari samanburðarlínu greindust aðeins minniháttar breytingar á flúrljómunarhlutfallinu í SAM, en í SAM miðjunni sáum við skýra og óvænta lækkun á VENUS tengdri TagBFP. Þetta staðfestir að merkjamynstrið sem qmRGA sér endurspeglar GA-háða niðurbrot mRGA-VENUS, en sýnir einnig að qmRGA gæti ofmetið GA-merkjavirkni í miðju frumþekjunnar. Í stuttu máli sýna niðurstöður okkar GA-merkjamynstur sem endurspeglar fyrst og fremst dreifingu frumþekjanna. Þessi dreifing milli frumþekjusvæðisins (IPR) stafar af því að mikil GA-merkjavirkni eykst smám saman milli frumþekjunnar sem er í þróun og miðsvæðisins, en á sama tíma minnkar GA-merkjavirkni í frumþekjunni (Mynd 4c, d).
Dreifing GID1b og GID1c viðtaka (sjá að ofan) bendir til þess að mismunandi tjáning GA viðtaka hjálpi til við að móta mynstur GA merkjavirkni í SAM. Við veltum fyrir okkur hvort mismunandi uppsöfnun GA gæti átt þátt í þessu. Til að kanna þennan möguleika notuðum við nlsGPS1 GA FRET skynjarann21. Aukin virkjunartíðni greindist í SAM nlsGPS1 sem meðhöndlað var með 10 μM GA4+7 í 100 mínútur (viðbótarmynd 9a-e), sem bendir til þess að nlsGPS1 bregst við breytingum á GA styrk í SAM, eins og það gerir í rótum21. Rýmisdreifing virkjunartíðni nlsGPS1 leiddi í ljós tiltölulega lágt GA gildi í ytri lögum SAM, en sýndi að þau voru hækkuð í miðju og við jaðar SAM (mynd 4e og viðbótarmynd 9a,c). Þetta bendir til þess að GA sé einnig dreift í SAM með rúmfræðilegu mynstri sem er sambærilegt við það sem qmRGA sýnir. Sem viðbótaraðferð meðhöndluðum við einnig SAM með flúrljómandi GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) eða Fl einu sér sem neikvæða samanburðarþátt. Fl merkið var dreift um allt SAM, þar á meðal miðsvæðið og frumhimnuna, þó með lægri styrkleika (Mynd 4j og viðbótarmynd 10d). Aftur á móti safnaðist öll þrjú GA-Fl sérstaklega upp innan frumhimnumarka og í mismunandi mæli í restinni af IPR, þar sem GA7-Fl safnaðist upp í stærsta svæðinu í IPR (Mynd 4k og viðbótarmynd 10a,b). Magnbundin ákvörðun á flúrljómunarstyrkleika leiddi í ljós að hlutfallið á milli IPR og óIPR var hærra í SAM meðhöndluðu með GA-Fl samanborið við SAM meðhöndluðu með Fl (Mynd 4l og viðbótarmynd 10c). Saman benda þessar niðurstöður til þess að GA sé til staðar í hærri styrk í IPR frumum sem eru staðsettar næst líffæramörkum. Þetta bendir til þess að mynstur SAM GA boðleiðavirkni stafi bæði af mismunandi tjáningu GA viðtaka og mismunandi uppsöfnun GA í IPR frumum nálægt líffæramörkum. Þannig leiddi greining okkar í ljós óvænt rúmfræðilegt og tímabundið mynstur GA boðleiða, með minni virkni í miðju og frumsvæði SAM og meiri virkni í IPR á jaðarsvæðinu.
Til að skilja hlutverk mismunandi GA-boðavirkni í SAM, greindum við fylgni milli GA-boðavirkni, frumuvöxtar og frumuskiptingar með því að nota rauntíma tímamælingu af SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Miðað við hlutverk GA í vaxtarstjórnun var búist við jákvæðri fylgni við frumuvöxtarbreytur. Þess vegna bárum við fyrst saman kort af GA-boðavirkni við kort af vaxtarhraða frumuyfirborðs (sem mælikvarði á styrk frumuvöxtar fyrir tiltekna frumu og fyrir dótturfrumur við skiptingu) og við kort af vaxtarmisotropíu, sem mælir stefnu frumuvöxtar (einnig notað hér fyrir tiltekna frumu og fyrir dótturfrumur við skiptingu; Mynd 5a,b, sjá Aðferðir og viðbótaraðferðir). Kort okkar af vaxtarhraða SAM-frumuyfirborðs eru í samræmi við fyrri athuganir38,39, með lágmarksvaxtarhraða við jaðarinn og hámarksvaxtarhraða í blómum í þróun (Mynd 5a). Aðalþáttagreining (PCA) sýndi að GA-boðavirkni var neikvætt tengd vaxtarstyrk frumuyfirborðs (Mynd 5c). Við sýndum einnig fram á að helstu breytileikaásar, þar á meðal GA-boðainntak og vaxtarstyrkleiki, voru hornréttir á stefnuna sem ákvarðast af mikilli CLV3-tjáningu, sem staðfestir útilokun frumna frá SAM-miðstöðinni í eftirstandandi greiningum. Spearman-fylgnigreining staðfesti PCA-niðurstöðurnar (mynd 5d), sem bendir til þess að hærri GA-merki í IPR leiddu ekki til meiri frumuvöxtar. Hins vegar leiddi fylgnigreining í ljós væga jákvæða fylgni milli GA-boðavirkni og vaxtaranísótrópíu (mynd 5c, d), sem bendir til þess að hærri GA-boð í IPR hafi áhrif á stefnu frumuvaxtar og hugsanlega staðsetningu frumuskiptingarplansins.
a, b Hitakort af meðalyfirborðsvexti (a) og vaxtarójafnvægi (b) í SAM að meðaltali yfir sjö óháðar plöntur (notaðar sem staðgenglar fyrir styrk og stefnu frumuvöxtar, talið í sömu röð). c PCA greining innihélt eftirfarandi breytur: GA merki, yfirborðsvaxtarstyrkleiki, yfirborðsvaxtarójafnvægi og CLV3 tjáningu. PCA þáttur 1 var aðallega neikvætt tengdur við yfirborðsvaxtarstyrkleika og jákvætt tengdur við GA merki. PCA þáttur 2 var aðallega jákvætt tengdur við yfirborðsvaxtarójafnvægi og neikvætt tengdur við CLV3 tjáningu. Prósentur tákna breytileika sem hver þáttur útskýrir. d Spearman fylgnigreining milli GA merkis, yfirborðsvaxtarstyrkleika og yfirborðsvaxtarójafnvægis á vefjakvarða að undanskildum CZ. Talan hægra megin er Spearman rho gildi milli tveggja breyta. Stjörnur gefa til kynna tilvik þar sem fylgni/neikvæð fylgni er mjög marktæk. e Þrívíddarsýn á Col-0 SAM L1 frumum með confocal smásjá. Nýir frumuveggir sem mynduðust í SAM (en ekki frumfrumunni) eftir 10 klst. eru litaðir eftir horngildum þeirra. Litastikan er sýnd neðst í hægra horninu. Innskotið sýnir samsvarandi þrívíddarmynd eftir kl. 0. Tilraunin var endurtekin tvisvar með svipuðum niðurstöðum. f Kassamyndir sýna frumuskiptingarhraða í IPR og ekki-IPR Col-0 SAM (n = 10 óháðar plöntur). Miðlínan sýnir miðgildið og kassamörkin gefa til kynna 25. og 75. hundraðshlutann. Vísbendingar gefa til kynna lágmarks- og hámarksgildi sem ákvörðuð voru með R hugbúnaði. P gildi fengust með tvíhliða Welch t-prófi. g, h Skýringarmynd sem sýnir (g) hvernig á að mæla horn nýja frumuveggsins (magenta) miðað við radíusstefnu frá miðju SAM (hvít punktalína) (aðeins hvass horngildi, þ.e. 0–90°, eru tekin með í reikninginn) og (h) ummáls-/hliðar- og radíusstefnur innan meristemsins. i Tíðnisúlurit af frumuskiptingarplansstefnu yfir SAM (dökkblátt), IPR (miðlungsblátt) og ekki-IPR (ljósblátt), talið í sömu röð. P-gildi fengust með tvíhliða Kolmogorov-Smirnov prófi. Tilraunin var endurtekin tvisvar með svipuðum niðurstöðum. j Tíðnisúlurit af stefnu frumuskiptingarplans IPR í kringum P3 (ljósgrænt), P4 (miðlungsgrænt) og P5 (dökkgrænt), talið í sömu röð. P-gildi fengust með tvíhliða Kolmogorov-Smirnov prófi. Tilraunin var endurtekin tvisvar með svipuðum niðurstöðum.
Þess vegna rannsökuðum við næst fylgni milli GA-boða og frumuskiptingar með því að bera kennsl á nýmyndaða frumuveggi meðan á prófuninni stóð (Mynd 5e). Þessi aðferð gerði okkur kleift að mæla tíðni og stefnu frumuskiptingar. Óvænt komumst við að því að tíðni frumuskiptingar í IPR og restinni af SAM (ekki-IPR, Mynd 5f) var svipuð, sem bendir til þess að munur á GA-boðagjöf milli IPR-frumna og frumna sem ekki eru IPR hafi ekki marktæk áhrif á frumuskiptingu. Þetta, ásamt jákvæðu fylgni milli GA-boða og vaxtarójöfnu, hvatti okkur til að íhuga hvort GA-boðagerð gæti haft áhrif á stefnu frumuskiptingarplansins. Við mældum stefnu nýja frumuveggsins sem hvasst horn miðað við geislaásinn sem tengir miðju frumuskiptingarinnar og miðju nýja frumuveggsins (Mynd 5e-i) og sáum greinilega tilhneigingu frumna til að skipta sér í hornum nálægt 90° miðað við geislaásinn, með hæstu tíðnina við 70–80° (23,28%) og 80–90° (22,62%) (Mynd 5e,i), sem samsvarar frumuskiptingu í ummáls-/þversátt (Mynd 5h). Til að kanna framlag GA-boða til þessarar frumuskiptingarhegðun greindum við frumuskiptingarbreytur í IPR og ekki-IPR sérstaklega (Mynd 5i). Við sáum að dreifing skiptingarhorna í IPR frumum var frábrugðin dreifingu í frumum sem ekki voru með IPR eða í frumum í öllu SAM frumunni, þar sem IPR frumur sýndu hærra hlutfall af hliðar-/hringlaga frumuskiptingu, þ.e. 70–80° og 80–90° (33,86% og 30,71%, talið í sömu röð, samsvarandi hlutföll) (Mynd 5i). Þannig leiddu athuganir okkar í ljós tengsl milli mikillar GA merkjasendingar og stefnu frumuskiptingarplans nálægt ummálsstefnu, svipað og fylgni milli GA merkjasendingarvirkni og vaxtarmisótrópíu (Mynd 5c, d). Til að staðfesta frekar rúmfræðilega varðveislu þessa tengsla mældum við stefnu skiptingarplans í IPR frumum sem umkringdu frumfrumuna frá P3, þar sem hæsta GA merkjasendingarvirknin greindist á þessu svæði frá P4 (Mynd 4). Skiptingarhorn IPR í kringum P3 og P4 sýndu engan tölfræðilega marktækan mun, þó að aukin tíðni hliðarfrumuskiptingar hafi sést í IPR í kringum P4 (Mynd 5j). Hins vegar, í IPR frumunum í kringum P5, varð munurinn á stefnu frumuskiptingarplansins tölfræðilega marktækur, með mikilli aukningu á tíðni þversfrumuskiptingar (Mynd 5j). Samanlagt benda þessar niðurstöður til þess að GA boð geti stjórnað stefnu frumuskiptingar í SAM, sem er í samræmi við fyrri skýrslur40,41 um að mikil GA boð geti örvað lárétta stefnu frumuskiptingar í IPR.
Spáð er að frumur í IPR verði ekki innlimaðar í frumfrumur heldur í millihnúta2,42,43. Þversnið frumuskiptingar í IPR gæti leitt til dæmigerðrar skipulagningar samsíða langsum raða af yfirhúðarfrumum í millihnútum. Athuganir okkar sem lýst er hér að ofan benda til þess að GA-boðleiðir gegni líklega hlutverki í þessu ferli með því að stjórna stefnu frumuskiptingar.
Tap á virkni nokkurra DELLA gena leiðir til stöðugs GA svars og hægt er að nota della stökkbreytingar til að prófa þessa tilgátu44. Við greindum fyrst tjáningarmynstur fimm DELLA gena í SAM. Umritunarsamruni GUS línunnar45 leiddi í ljós að GAI, RGA, RGL1 og RGL2 (í mun minna mæli) voru tjáð í SAM (viðbótarmynd 11a-d). In situ blendingur sýndi enn fremur að GAI mRNA safnast sérstaklega fyrir í frumstæðum blómum og blómum í þróun (viðbótarmynd 11e). RGL1 og RGL3 mRNA greindust um allt SAM laufþakið og í eldri blómum, en RGL2 mRNA var algengara á jaðarsvæðinu (viðbótarmynd 11f-h). Samsærismyndgreining á pRGL3::RGL3-GFP SAM staðfesti tjáninguna sem sást með in situ blendingum og sýndi að RGL3 prótein safnast fyrir í miðhluta SAM (viðbótarmynd 11i). Með því að nota pRGA::GFP-RGA línuna komumst við einnig að því að RGA prótein safnast fyrir í SAM, en magn þess minnkar við mörkin frá og með P4 (viðbótarmynd 11j). Athyglisvert er að tjáningarmynstur RGL3 og RGA eru í samræmi við meiri GA merkjagjöf í IPR, eins og greint er með qmRGA (mynd 4). Ennfremur benda þessi gögn til þess að öll DELLA séu tjáð í SAM og að tjáning þeirra samanlagt spannar allt SAM.
Næst greindum við frumuskiptingarbreyturnar í villtu gerð SAM (Ler, samanburðarhópur) og gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della fimmfalda (alþjóðlega) stökkbreytingunum (Mynd 6a, b). Athyglisvert er að við sáum tölfræðilega marktæka breytingu á dreifingu tíðni frumuskiptingarhorna í della global stökkbreytta SAM samanborið við villtu gerðina (Mynd 6c). Þessi breyting í della global stökkbreytingunni stafaði af aukningu á tíðni 80–90° horna (34,71% á móti 24,55%) og, í minna mæli, 70–80° horna (23,78% á móti 20,18%), þ.e. samsvarar þversfrumuskiptingu (Mynd 6c). Tíðni óþversfrumuskiptingar (0–60°) var einnig lægri í della global stökkbreytingunni (Mynd 6c). Tíðni þversfrumuskiptingar jókst marktækt í SAM della global stökkbreytingarinnar (Mynd 6b). Tíðni þversfrumuskiptingar í IPR var einnig hærri í della global stökkbreytingunni samanborið við villta gerðina (Mynd 6d). Utan IPR svæðisins hafði villta gerðin jafnari dreifingu frumuskiptingarhorna, en della global stökkbreytingin kaus frekar snertiskiptingar eins og IPR (Mynd 6e). Við magngreindum einnig stefnu frumuskiptingar í SAM fimmtunga ga2 oxídasa (ga2ox) stökkbreytinga (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 og ga2ox6-2), GA-óvirkan stökkbreytingarbakgrunn þar sem GA safnast fyrir. Í samræmi við aukningu á GA-gildum var SAM fimmfalda ga2ox stökkbreytta blómstökkbreytingarinnar stærri en Col-0 (viðbótarmynd 12a, b), og samanborið við Col-0 sýndi fimmfalda ga2ox SAM greinilega mismunandi dreifingu frumuskiptingarhorna, þar sem horntíðnin jókst úr 50° í 90°, þ.e. aftur í hag snertingarskiptingar (viðbótarmynd 12a-c). Þannig sýnum við fram á að stöðug virkjun GA-boða og GA-uppsöfnun veldur hliðarfrumuskiptingu í IPR og restinni af SAM.
a, b Þrívíddarmynd af L1 lagi af PI-lituðu Ler (a) og alþjóðlegu della stökkbreyttu (b) SAM með confocal smásjá. Nýir frumuveggir sem mynduðust í SAM (en ekki frumfrumunni) yfir 10 klst. tímabil eru sýndir og litaðir eftir horngildum þeirra. Innskotið sýnir SAM við 0 klst. Litastikuna er sýnd í neðra hægra horninu. Örin í (b) bendir á dæmi um samstilltar frumuskrár í alþjóðlegu della stökkbreyttu. Tilraunin var endurtekin tvisvar með svipuðum niðurstöðum. ce samanburður á tíðnidreifingu frumuskiptingarplana í öllu SAM (d), IPR (e) og ekki-IPR (f) milli Ler og alþjóðlegu della. P gildi voru fengin með tvíhliða Kolmogorov-Smirnov prófi. f, g Þrívíddarmynd af confocal myndum af PI-lituðu SAM af Col-0 (i) og pCUC2::gai-1-VENUS (j) erfðabreyttum plöntum. Spjöld (a, b) sýna nýja frumuveggi (en ekki frumfrumur) sem mynduðust í SAM innan 10 klst. Tilraunin var endurtekin tvisvar með svipuðum niðurstöðum. h–j Samanburður á tíðnidreifingu frumuskiptingarplana í öllu SAM (h), IPR (i) og ekki-IPR (j) milli Col-0 og pCUC2::gai-1-VENUS plantna. P gildi voru fengin með tvíhliða Kolmogorov–Smirnov prófi.
Næst prófuðum við áhrif þess að hamla GA merkjagjöf sérstaklega í IPR. Í þessu skyni notuðum við cotyledon cup 2 (CUC2) hvata til að knýja áfram tjáningu ríkjandi neikvæðs gai-1 próteins sem var sameinað VENUS (í pCUC2::gai-1-VENUS línunni). Í villta gerð SAM knýr CUC2 hvatinn áfram tjáningu flestra IPR í SAM, þar á meðal jaðarfrumum, frá P4 og áfram, og svipuð sértæk tjáning sást í pCUC2::gai-1-VENUS plöntum (sjá hér að neðan). Dreifing frumuskiptingarhorna yfir SAM eða IPR í pCUC2::gai-1-VENUS plöntum var ekki marktækt frábrugðin því í villta gerðinni, þó að óvænt komumst við að því að frumur án IPR í þessum plöntum skiptu sér með hærri tíðni, 80–90° (Mynd 6f–j).
Því hefur verið haldið fram að stefna frumuskiptingar sé háð rúmfræði SAM, sérstaklega togspennu sem myndast af vefjasveigju46. Við spurðum því hvort lögun SAM hefði breyst í della global stökkbreytingunni og pCUC2::gai-1-VENUS plöntunum. Eins og áður hefur verið greint frá12, var stærð della global stökkbreytingarinnar SAM meiri en villta gerðin (viðbótarmynd 13a, b, d). In situ blendingur CLV3 og STM RNA staðfesti meristem útvíkkun í della stökkbreytingum og sýndi enn fremur lárétta útvíkkun stofnfrumuníðunnar (viðbótarmynd 13e, f, h, i). Hins vegar var SAM sveigjan svipuð í báðum arfgerðum (viðbótarmynd 13k, m, n, p). Við sáum svipaða stærðaraukningu í gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della fjórfalda stökkbreytingunni án breytinga á sveigju samanborið við villta gerðina (viðbótarmynd 13c, d, g, j, l, o, p). Tíðni frumuskiptingar hafði einnig áhrif í fjórfalda della stökkbreytingunni, en í minna mæli en í einfalda della stökkbreytingunni (viðbótarmynd 12d–f). Þessi skammtaáhrif, ásamt skorti á áhrifum á sveigju, benda til þess að eftirstandandi RGL3 virkni í fjórfalda Della stökkbreytingunni takmarki breytingar á frumuskiptingarstefnu sem orsakast af tapi á DELLA virkni og að breytingar á hliðarfrumuskiptingu eigi sér stað sem svar við breytingum á GA merkjavirkni frekar en breytingum á SAM lögun. Eins og lýst er hér að ofan, knýr CUC2 hvatinn IPR tjáningu í SAM frá P4 (viðbótarmynd 14a, b), og hins vegar hafði pCUC2::gai-1-VENUS SAM minni stærð en meiri sveigju (viðbótarmynd 14c–h). Þessi breyting á pCUC2::gai-1-VENUS SAM formgerð gæti leitt til annarrar dreifingar vélræns álags samanborið við villta gerðina, þar sem mikil ummálsspenna byrjar í styttri fjarlægð frá SAM miðjunni47. Einnig gætu breytingarnar á formgerð pCUC2::gai-1-VENUS SAM stafað af breytingum á svæðisbundnum vélrænum eiginleikum sem framkallaðar eru af erfðabreyttum genum48. Í báðum tilvikum gæti þetta að hluta til vegað upp á móti áhrifum breytinga á GA-boðleiðum með því að auka líkurnar á að frumur skipti sér í ummál/þversum, sem skýrir athuganir okkar.
Samanlagt staðfesta gögn okkar að meiri GA-boðleiðir gegna virku hlutverki í láréttri stefnu frumuskiptingarplansins í IPR. Þau sýna einnig að sveigja meristemsins hefur einnig áhrif á stefnu frumuskiptingarplansins í IPR.
Þverstliggjandi stefna skiptingarplansins í IPR, vegna mikillar GA-boðavirkni, bendir til þess að GA forskipulagi geislamyndaða frumuskrá í yfirhúðinni innan SAM til að skilgreina frumuskipulagið sem síðar finnst í millihnút yfirhúðarinnar. Reyndar voru slíkar frumuskrár oft sýnilegar á SAM myndum af della global stökkbreytingum (Mynd 6b). Til að kanna frekar þroskahlutverk rúmfræðilegs mynsturs GA-boða í SAM, notuðum við tímamælingar til að greina rúmfræðilega skipulagningu frumna í IPR í villtum gerðum (Ler og Col-0), della global stökkbreytingum og pCUC2::gai-1-VENUS erfðabreyttum plöntum.
Við komumst að því að qmRGA sýndi að GA merkjavirkni í IPR jókst frá P1/P2 og náði hámarki við P4, og þetta mynstur hélst stöðugt með tímanum (Mynd 4a–f og Viðbótarmyndir 8c–f, k). Til að greina rúmfræðilega skipulagningu frumna í IPR með vaxandi GA merki, merktum við Ler IPR frumur fyrir ofan og til hliðar við P4 eftir þroska þeirra sem greindar voru 34 klst. eftir fyrstu athugun, þ.e. meira en tvisvar sinnum plastíð, sem gerir okkur kleift að fylgja IPR frumum meðan á frumþroska stóð frá P1/P2 til P4. Við notuðum þrjá mismunandi liti: gulan fyrir þær frumur sem voru samþættar frumsvæðinu nálægt P4, grænan fyrir þær sem voru í IPR og fjólubláan fyrir þær sem tóku þátt í báðum ferlum (Mynd 7a–c). Við t0 (0 klst.) voru 1–2 lög af IPR frumum sýnileg fyrir framan P4 (Mynd 7a). Eins og búist var við, þegar þessar frumur skiptu sér, gerðu þær það aðallega í gegnum þversniðs skiptingarfletinn (Myndir 7a–c). Svipaðar niðurstöður fengust með því að nota Col-0 SAM (með áherslu á P3, þar sem jaðarinn brotnar saman á svipaðan hátt og P4 í Ler), þó að í þessari arfgerð hafi brotið sem myndaðist við blómajaðarinn falið IPR frumurnar hraðar (Mynd 7g–i). Þannig skipuleggur skiptingarmynstur IPR frumna frumurnar fyrirfram í geislalaga raðir, eins og í millihnútum. Skipulag geislalaga raða og staðsetning IPR frumna milli líffæra á milli þeirra bendir til þess að þessar frumur séu forverar millihnúta.
Hér þróuðum við hlutfallslegan GA merkjaleiðarlíffræðilegan skynjara, qmRGA, sem gerir kleift að kortleggja magnbundna GA merkjavirkni sem stafar af sameinuðum GA og GA viðtakaþéttni, en lágmarkar truflun á innrænum merkjaleiðum og veitir þannig upplýsingar um GA virkni á frumustigi. Í þessu skyni smíðuðum við breytt DELLA prótein, mRGA, sem hefur misst getu sína til að bindast DELLA víxlverkunaraðilum en er enn næmt fyrir GA-völdum próteinsundrun. qmRGA bregst við bæði utanaðkomandi og innrænum breytingum á GA stigum og kraftmiklir skynjunareiginleikar þess gera kleift að meta rúmfræðilegar og tímabundnar breytingar á GA merkjavirkni meðan á þroska stendur. qmRGA er einnig mjög sveigjanlegt tól þar sem það er hægt að aðlaga að mismunandi vefjum með því að breyta hvata sem notaður er fyrir tjáningu þess (ef nauðsyn krefur) og miðað við varðveittan eðli GA merkjaleiðarinnar og PFYRE mótífsins yfir dulfrævinga er líklegt að það sé yfirfæranlegt á aðrar tegundir22. Í samræmi við þetta sýndi jafngild stökkbreyting í SLR1 DELLA próteininu í hrísgrjónum (HYY497AAA) einnig fram á að bæla vaxtarbælandi virkni SLR1 en aðeins draga lítillega úr GA-miðlaðri niðurbroti þess, svipað og mRGA23. Athyglisvert er að nýlegar rannsóknir á Arabidopsis sýndu að stök amínósýrustökkbreyting í PFYRE léninu (S474L) breytti umritunarvirkni RGA án þess að hafa áhrif á getu þess til að hafa samskipti við umritunarþætti samstarfsaðila50. Þó að þessi stökkbreyting sé mjög nálægt þeim 3 amínósýruskiptin sem eru til staðar í mRGA, sýna rannsóknir okkar að þessar tvær stökkbreytingar breyta mismunandi eiginleikum DELLA. Þó að flestir umritunarþættir samstarfsaðilar bindist LHR1 og SAW lénunum í DELLA26,51, geta sumar varðveittar amínósýrur í PFYRE léninu hjálpað til við að koma á stöðugleika í þessum milliverkunum.
Þroski millihnúta er lykilatriði í plöntubyggingu og aukinni uppskeru. qmRGA sýndi fram á meiri GA boðleiðni í forverafrumum millihnúta IPR. Með því að sameina megindlega myndgreiningu og erfðafræði sýndum við fram á að GA boðleiðnimynstur leggjast yfir hringlaga/þverslægar frumuskiptingarfleti í SAM yfirhúðinni og móta frumuskiptingarskipulagið sem þarf fyrir þroska millihnúta. Nokkrir stjórnendur stefnu frumuskiptingarfletis hafa verið greindir meðan á þroska stendur52,53. Verk okkar veitir skýrt dæmi um hvernig GA boðleiðni stjórnar þessum frumubreytu. DELLA getur haft samskipti við forfelldar próteinfléttur41, þannig að GA boðleiðni gæti stjórnað stefnu frumuskiptingarfletis með því að hafa bein áhrif á stefnu örpípla í heilaberki40,41,54,55. Við sýndum óvænt fram á að í SAM var fylgni meiri GA boðleiðni ekki frumulenging eða skipting, heldur aðeins vaxtarmisótrópía, sem er í samræmi við bein áhrif GA á stefnu frumuskiptingar í IPR. Hins vegar getum við ekki útilokað að þessi áhrif gætu einnig verið óbein, til dæmis miðluð af GA-völdum mýkingu frumuveggja56. Breytingar á eiginleikum frumuveggja valda vélrænu álagi57,58, sem getur einnig haft áhrif á stefnu frumuskiptingarplansins með því að hafa áhrif á stefnu örpípla í heilaberki39,46,59. Samanlögð áhrif vélræns álags af völdum GA og beinnar stjórnun á stefnu örpípla með GA gætu átt þátt í að mynda ákveðið mynstur frumuskiptingarstefnu í IPR til að skilgreina millihnúta og frekari rannsókna er þörf til að prófa þessa hugmynd. Á sama hátt hafa fyrri rannsóknir bent á mikilvægi DELLA-samverkandi próteinanna TCP14 og 15 í stjórnun á myndun millihnúta60,61 og þessir þættir geta miðlað virkni GA ásamt BREVIPEDICELLUS (BP) og PENNYWISE (PNY), sem stjórna þroska millihnúta og hafa reynst hafa áhrif á GA-boðleiðir2,62. Þar sem DELLA-hormón hafa samskipti við boðleiðir brassinosteroids, etýlens, jasmonsýru og abscisic acid (ABA)63,64 og að þessi hormón geta haft áhrif á stefnu örpípla65, gætu áhrif GA á stefnu frumuskiptingar einnig verið miðluð af öðrum hormónum.
Snemma frumufræðilegar rannsóknir sýndu að bæði innri og ytri svæði SAM Arabidopsis eru nauðsynleg fyrir þroska millihnúta2,42. Sú staðreynd að GA stjórnar virkt frumuskiptingu í innri vefjum12 styður tvíþætta virkni GA við að stjórna frumuskiptingu og stærð millihnúta í SAM. Mynstur stefnubundinnar frumuskiptingar er einnig vel stjórnað í innri SAM vefnum, og þessi stjórnun er nauðsynleg fyrir stilkvöxt52. Það verður áhugavert að skoða hvort GA gegnir einnig hlutverki í að stefnumóta frumuskiptingarplanið í innri SAM skipulagi, og þar með samstilla forritun og þroska millihnúta innan SAM.
Plöntur voru ræktaðar in vitro í jarðvegi eða 1x Murashige-Skoog (MS) æti (Duchefa) bætt við 1% súkrósa og 1% agar (Sigma) við stöðluð skilyrði (16 klst. ljós, 22°C), nema í tilraunum með kímblöð og rótarvöxt þar sem plöntur voru ræktaðar á lóðréttum plötum við stöðugt ljós og 22°C. Fyrir nítrattilraunirnar voru plöntur ræktaðar á breyttum MS æti (bioWORLD plöntuæti) bætt við nægilegu nítrati (0 eða 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-súksínati, 1% súkrósa og 1% A-agar (Sigma) við langan dag.
GID1a cDNA sem sett var inn í pDONR221 var endursameinað við pDONR P4-P1R-pUBQ10 og pDONR P2R-P3-mCherry í pB7m34GW til að mynda pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 DNA sem sett var inn í pDONR221 var endursameinað í pB7RWG266 til að mynda p35S:IDD2-RFP. Til að búa til pGID1b::2xmTQ2-GID1b var 3,9 kb brot fyrir ofan GID1b kóðunarsvæðið og 4,7 kb brot sem innihélt GID1b cDNA (1,3 kb) og terminator (3,4 kb) fyrst magnað með því að nota praimera í viðbótartöflu 3 og síðan sett inn í pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) og pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), talið í sömu röð, og að lokum endursameinað við pDONR221 2xmTQ268 í pGreen 012567 markvektorinn með því að nota Gateway klónun. Til að búa til pCUC2::LSSmOrange var CUC2 hvataröðin (3229 bp fyrir ofan ATG) og síðan kóðunarröð stórs Stokes-skiptaðs mOrange (LSSmOrange)69 með N7 kjarnastaðsetningarmerkinu og NOS umritunarlokanum sett saman í pGreen kanamycin markvekturinn með því að nota Gateway 3-fragment endurröðunarkerfið (Invitrogen). Tvíundarvekturinn úr plöntunni var settur inn í Agrobacterium tumefaciens stofn GV3101 og settur inn í Nicotiana benthamiana lauf með Agrobacterium íferðaraðferð og í Arabidopsis thaliana Col-0 með blómadýfingaraðferð, talið í sömu röð. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry og pCLV3::mCherry-NLS qmRGA voru einangruð úr F3 og F1 afkvæmum viðkomandi krossa, talið í sömu röð.
RNA in situ blendingur var framkvæmdur á um það bil 1 cm löngum sprotaoddum72, sem voru safnaðir og strax festir í FAA lausn (3,7% formaldehýð, 5% ediksýra, 50% etanól) sem hafði verið forkældur niður í 4°C. Eftir 2 × 15 mínútna lofttæmismeðferð var festiefninu skipt út og sýnin voru ræktuð yfir nótt. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 og RGL3 cDNA og andhverfupróf fyrir 3′-UTR þeirra voru mynduð með því að nota praimera sem sýndir eru í viðbótartöflu 3 eins og lýst er af Rosier o.fl.73. Digoxigenín-merktum mæliprófum var ónæmisgreint með digoxigenín-mótefnum (3000-föld þynning; Roche, vörulistanúmer: 11 093 274 910) og sneiðarnar voru litaðar með 5-brómó-4-klór-3-indólýlfosfat (BCIP, 250-föld þynning)/nítróblátt tetrazólíum (NBT, 200-föld þynning) lausn.
Birtingartími: 10. febrúar 2025