Shoot apical meristem (SAM) vöxtur er mikilvægur fyrir stilkur arkitektúr. Plöntuhormóngibberellins(GA) gegna lykilhlutverki við að samræma vöxt plantna, en hlutverk þeirra í SAM er enn illa skilið. Hér þróuðum við hlutfallsmælanlega lífskynjara fyrir GA merkjasendingar með því að þróa DELLA próteinið til að bæla niður nauðsynlega stjórnunarvirkni þess í GA umritunarsvöruninni en varðveita niðurbrot þess við GA viðurkenningu. Við sýnum að þessi niðurbrotsbyggði lífskynjari skráir nákvæmlega breytingar á GA stigum og frumuskynjun meðan á þróun stendur. Við notuðum þennan lífskynjara til að kortleggja GA merkjavirkni í SAM. Við sýnum að há GA merki eru aðallega til staðar í frumum sem eru staðsettar á milli frumufruma líffæra, sem eru undanfari innheimtu frumna. Með því að nota nálganir á ávinningi og tapi á virkni, sýnum við enn frekar fram á að GA stjórnar stefnu frumuskiptingarplansins, kemur á staðbundnu frumuskipulagi millihnúta, og stuðlar þar með að millihnútaforskrift í SAM.
Skjóta apical meristem (SAM), sem staðsett er á skottoppi, inniheldur sess stofnfrumna sem virkni myndar hliðarlíffæri og stofnhnúta á máta og endurtekinn hátt alla ævi plöntunnar. Hver af þessum endurteknu einingum, eða plöntuhnútum, inniheldur millihnúta og hliðarlíffæri við hnúðana, og axilla meristems í blaðöxlum1. Vöxtur og skipulag plöntuhnúta breytist við þróun. Í Arabidopsis er vöxtur innanfrumna bældur á gróðurstigi og axillar meristems liggja í dvala í öxlum rósettu laufanna. Við umskipti yfir í blómafasa verður SAM að blómstrandi meristem, sem myndar ílangar millihnúða og axillaknúpa, greinar í öxlum á kálblöðum og síðar lauflaus blóm2. Þrátt fyrir að við höfum náð umtalsverðum framförum í skilningi á aðferðum sem stjórna upphaf blaða, blóma og útibúa, er tiltölulega lítið vitað um hvernig internótar verða til.
Skilningur á tímabundinni dreifingu GA mun hjálpa til við að skilja betur virkni þessara hormóna í mismunandi vefjum og á mismunandi þroskastigum. Sjónmynd af niðurbroti RGA-GFP samruna sem tjáð er undir aðgerð eigin verkefnisstjóra gefur mikilvægar upplýsingar um stjórnun heildarmagns GA í rótum15,16. Hins vegar er RGA tjáning mismunandi eftir vefjum17 og er stjórnað af GA18. Þannig getur mismunatjáning á RGA-hvatanum leitt til flúrljómunarmynsturs sem sést með RGA-GFP og því er þessi aðferð ekki megindleg. Nýlega leiddi lífvirkt flúrljómun (Fl) merkt GA19,20 í ljós uppsöfnun GA í innkirtlarót rótarinnar og stjórnun á frumuþéttni þess með GA flutningi. Nýlega sýndi GA FRET skynjarinn nlsGPS1 að GA-magn tengist lengingu frumna í rótum, þráðum og dökkvöxnum hypocotyls21. Hins vegar, eins og við höfum séð, er GA styrkur ekki eina færibreytan sem stjórnar GA merkjavirkni, þar sem hún er háð flóknum skynjunarferlum. Hér, byggt á skilningi okkar á DELLA og GA boðleiðum, greinum við frá þróun og lýsingu á niðurbrotsbundnum hlutfallsmælingum lífskynjara fyrir GA boð. Til að þróa þennan megindlega lífskynjara notuðum við stökkbreytt GA-næmt RGA sem var blandað saman við flúrljómandi prótein og tjáð alls staðar í vefjum, sem og GA-ónæmt flúrljómandi prótein. Við sýnum að stökkbreyttu RGA próteinsamrunarnir trufla ekki innræn GA boð þegar þau eru tjáð alls staðar og að þessi lífskynjari getur mælt merkjavirkni sem stafar af bæði GA inntak og GA merki vinnslu skynjunarbúnaðarins með mikilli tímaupplausn. Við notuðum þennan lífskynjara til að kortleggja tímabundna dreifingu GA merkjavirkni og mæla hvernig GA stjórnar frumuhegðun í SAM húðþekju. Við sýnum fram á að GA stjórnar stefnu skiptingarplans SAM frumna sem staðsettar eru á milli frumhimnu líffæra og skilgreinir þar með kanónískt frumuskipulag millihúðarinnar.
Að lokum spurðum við hvort qmRGA gæti greint frá breytingum á innrænu GA stigum með því að nota vaxandi hypocotyls. Við sýndum áður að nítrat örvar vöxt með því að auka GA nýmyndun og aftur á móti DELLA34 niðurbrot. Í samræmi við það tókum við eftir því að pUBQ10::qmRGA plöntur sem ræktaðar voru undir miklu nítratframboði (10 mM NO3-) var marktækt lengri en hjá plöntum sem ræktaðar voru við nítratskort (viðbótarmynd. 6a). Í samræmi við vaxtarsvörunina voru GA merki hærri í blóðfrumum ungplöntur sem ræktaðar voru við 10 mM NO3− aðstæður en í plöntum sem ræktaðar voru án nítrats (viðbótarmynd. 6b, c). Þannig gerir qmRGA einnig kleift að fylgjast með breytingum á GA merkjasendingum af völdum innrænna breytinga á GA styrk.
Til að skilja hvort GA-merkjavirkni sem greinist með qmRGA veltur á GA styrk og GA skynjun, eins og búist var við út frá skynjarahönnuninni, greindum við tjáningu þriggja GID1 viðtaka í gróður- og æxlunarvef. Í plöntum sýndi GID1-GUS fréttaritarlínan að GID1a og c voru mjög tjáð í kímblöðrum (mynd 3a-c). Að auki voru allir þrír viðtakarnir tjáðir í laufum, hliðrótarprimordia, rótaroddum (nema rótarhettu GID1b) og æðakerfi (mynd 3a–c). Í blómstrandi SAM fundum við GUS merki eingöngu fyrir GID1b og 1c (aukamynd. 7a–c). In situ blending staðfesti þessi tjáningarmynstur og sýndi ennfremur að GID1c var einsleitt tjáð við lágt magn í SAM, en GID1b sýndi meiri tjáningu á jaðri SAM (viðbótarmynd. 7d-l). Þýðingarsamruni pGID1b::2xmTQ2-GID1b leiddi einnig í ljós stigbundið svið GID1b tjáningar, frá lítilli eða engri tjáningu í miðju SAM til mikillar tjáningar á líffæramörkum (viðbótarmynd 7m). Þannig dreifast GID1 viðtakar ekki jafnt yfir og innan vefja. Í síðari tilraunum sáum við einnig að oftjáning á GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) jók næmi qmRGA í hypocotyls fyrir utanaðkomandi GA notkun (mynd 3d, e). Aftur á móti var flúrljómun mæld með qd17mRGA í hypocotylinu ónæm fyrir GA3 meðferð (mynd 3f, g). Fyrir báðar prófanir voru plöntur meðhöndlaðar með háum styrk af GA (100 μM GA3) til að meta hraða hegðun skynjarans, þar sem hæfni til að bindast GID1 viðtakanum jókst eða glataðist. Saman staðfesta þessar niðurstöður að qmRGA lífskynjari þjónar sameinuðu hlutverki sem GA og GA skynjari, og benda til þess að mismunatjáning GID1 viðtakans geti breytt losun skynjarans verulega.
Hingað til er dreifing GA merkja í SAM óljós. Þess vegna notuðum við qmRGA-tjáandi plöntur og pCLV3::mCherry-NLS stofnfrumuskýrsluna35 til að reikna út háupplausnar magnkort af GA-merkjavirkni, með áherslu á L1-lagið (epidermis; mynd 4a, b, sjá aðferðir og viðbótaraðferðir), þar sem L1 gegnir lykilhlutverki í vexti SAM36. Hér gaf pCLV3::mCherry-NLS tjáning fastan rúmfræðilegan viðmiðunarpunkt til að greina tímabundna dreifingu GA merkjavirkni37. Þrátt fyrir að GA sé talið nauðsynlegt fyrir þróun hliðarlíffæra4, sáum við að GA merki voru lítil í blóma frumu (P) frá og með P3 stigi (mynd 4a, b), en ungir P1 og P2 frumur höfðu miðlungs virkni svipað og á miðsvæðinu (mynd 4a, b). Hærri GA-merkjavirkni greindist á frumumörkum líffæra, sem byrjaði á P1/P2 (við hliðar landamæranna) og náði hámarki við P4, sem og í öllum frumum útlæga svæðisins sem staðsettar eru á milli primordia (mynd 4a, b og aukamynd 8a, b). Þessi meiri GA merkjavirkni sást ekki aðeins í húðþekju heldur einnig í L2 og efri L3 lögum (viðbótarmynd 8b). Mynstur GA merkja sem fannst í SAM með því að nota qmRGA hélst einnig óbreytt með tímanum (aukamynd. 8c–f, k). Þrátt fyrir að qd17mRGA byggingin hafi verið kerfisbundið niðurstýrð í SAM T3 plantna úr fimm sjálfstæðum línum sem við einkenndum í smáatriðum, gátum við greint flúrljómunarmynstrið sem fengist með pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP byggingunni (aukamynd. 8g-j, l). Í þessari viðmiðunarlínu greindust aðeins minniháttar breytingar á flúrljómunarhlutfalli í SAM, en í SAM miðstöðinni sáum við skýra og óvænta lækkun á VENUS sem tengist TagBFP. Þetta staðfestir að merkjamynstrið sem qmRGA sést endurspeglar GA-háð niðurbrot mRGA-VENUS, en sýnir einnig að qmRGA gæti ofmetið GA merkjavirkni í meristem miðjunni. Í stuttu máli sýna niðurstöður okkar GA merkjamynstur sem endurspeglar fyrst og fremst dreifingu frumkvilla. Þessi dreifing á inter-primordial svæðinu (IPR) er vegna þess að hægt er að koma á mikilli GA-merkjavirkni milli frumorpu og miðsvæðis, en á sama tíma minnkar GA-merkjavirkni í frumefni (mynd 4c, d).
Dreifing GID1b og GID1c viðtaka (sjá hér að ofan) bendir til þess að mismunandi tjáning GA viðtaka hjálpi til við að móta mynstur GA merkjavirkni í SAM. Við veltum því fyrir okkur hvort mismunasöfnun GA gæti átt við. Til að kanna þennan möguleika notuðum við nlsGPS1 GA FRET skynjarann21. Aukin virkjunartíðni greindist í SAM nlsGPS1 sem var meðhöndlað með 10 μM GA4+7 í 100 mínútur (viðbótarmynd. 9a-e), sem gefur til kynna að nlsGPS1 bregst við breytingum á GA styrk í SAM, eins og það gerir í rótum21. Staðbundin dreifing nlsGPS1 virkjunartíðni leiddi í ljós tiltölulega lágt GA gildi í ytri lögum SAM, en sýndi að þau voru hækkuð í miðju og á mörkum SAM (mynd 4e og viðbótarmynd 9a, c). Þetta bendir til þess að GA sé einnig dreift í SAM með staðbundnu mynstri sem er sambærilegt því sem qmRGA sýnir. Sem viðbótaraðferð meðhöndluðum við einnig SAM með flúrljómandi GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) eða Fl eingöngu sem neikvæða viðmiðun. Fl merkinu var dreift um SAM, þar með talið miðsvæðið og frumefnið, þó með lægri styrkleika (mynd 4j og aukamynd 10d). Aftur á móti söfnuðust öll þrjú GA-Fl upp sérstaklega innan frumlandamæranna og í mismiklum mæli í restinni af IPR, þar sem GA7-Fl safnaðist fyrir í stærsta léninu í IPR (mynd 4k og viðbótarmynd 10a, b). Magngreining á styrk flúrljómunar leiddi í ljós að hlutfall IPR og ekki IPR styrkleika var hærra í GA-Fl-meðhöndluðum SAM samanborið við Fl-meðhöndlaða SAM (mynd 4l og viðbótarmynd 10c). Saman benda þessar niðurstöður til þess að GA sé til staðar í hærri styrk í IPR frumum sem eru staðsettar næst líffæramörkum. Þetta bendir til þess að mynstur SAM GA merkjavirkni stafar bæði af mismunandi tjáningu GA viðtaka og mismunandi uppsöfnun GA í IPR frumum nálægt landamærum líffæra. Þannig leiddi greining okkar í ljós óvænt tímabundið mynstur GA merkja, með minni virkni í miðju og frumstigi SAM og meiri virkni í IPR á jaðarsvæðinu.
Til að skilja hlutverk mismunaðrar GA-merkjavirkni í SAM greindum við fylgni milli GA-boðavirkni, frumuútþenslu og frumuskiptingar með því að nota rauntíma tíma-lapse myndgreiningu á SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Í ljósi hlutverks GA í vaxtarstjórnun var búist við jákvæðri fylgni við frumuþenslubreytur. Þess vegna bárum við fyrst GA-merkjavirknikort saman við kort af vaxtarhraða frumuyfirborðs (sem mælikvarði á styrk frumuþenslu fyrir tiltekna frumu og fyrir dótturfrumur við skiptingu) og við kort af vaxtar-anisotropy, sem mælir stefnu frumuþenslu (einnig notað hér fyrir tiltekna frumu og fyrir dótturfrumur við skiptingu; mynd 5a,b, sjá aðferðir og viðbótaraðferðir). Kortin okkar af SAM frumu yfirborði vaxtarhraða eru í samræmi við fyrri athuganir38,39, með lágmarks vaxtarhraða við landamærin og hámarks vaxtarhraða í að þróa blóm (mynd 5a). Aðalþáttagreining (PCA) sýndi að GA-merkjavirkni var neikvæð fylgni við vöxt frumuyfirborðs (Mynd 5c). Við sýndum einnig að aðalásar breytileikans, þar á meðal GA-merkjainntak og vaxtarstyrkur, voru hornrétt á þá stefnu sem ákvarðast af mikilli CLV3 tjáningu, sem staðfestir útilokun frumna frá SAM miðstöðinni í greiningunum sem eftir eru. Spearman fylgnigreining staðfesti PCA niðurstöðurnar (Mynd 5d), sem gefur til kynna að hærri GA merki í IPR hafi ekki leitt til meiri frumuþenslu. Fylgnigreining leiddi hins vegar í ljós örlítið jákvæða fylgni á milli GA-merkjavirkni og vaxtar anisotropy (Mynd 5c, d), sem bendir til þess að hærri GA-boð í IPR hafi áhrif á stefnu frumuvaxtar og hugsanlega staðsetningu frumuskiptaplansins.
a, b Hitakort af meðalyfirborðsvexti (a) og vaxtaranísótrópíu (b) í SAM voru að meðaltali yfir sjö sjálfstæðar plöntur (notuð sem umboð fyrir styrk og stefnu frumuþenslu, í sömu röð). c PCA greining innihélt eftirfarandi breytur: GA merki, yfirborðsvaxtarstyrkur, yfirborðsvöxtur anisotropy og CLV3 tjáning. PCA hluti 1 var aðallega neikvæð fylgni við yfirborðsvaxtarstyrk og jákvæð fylgni við GA merki. PCA hluti 2 var aðallega í jákvæðri fylgni við yfirborðsvöxt anisotropy og neikvæða fylgni við CLV3 tjáningu. Prósentur tákna breytileikann sem skýrist af hverjum þætti. d Spearman fylgnigreining á milli GA merkis, yfirborðsvaxtarstyrks og yfirborðsvaxtar anisotropy á vefjakvarða að undanskildum CZ. Talan til hægri er Spearman rho gildið á milli tveggja breyta. Stjörnumerki gefa til kynna tilvik þar sem fylgni/neikvæð fylgni er mjög marktæk. e 3D sjónmynd af Col-0 SAM L1 frumum með confocal smásjá. Nýir frumuveggir sem myndast í SAM (en ekki primordium) eftir 10 klst eru litaðir í samræmi við horngildi þeirra. Litastikan er sýnd neðst í hægra horninu. Innfellingin sýnir samsvarandi þrívíddarmynd á 0 klst. Tilraunin var endurtekin tvisvar með svipuðum árangri. f Box plots sýna frumuskiptingu í IPR og non-IPR Col-0 SAM (n = 10 sjálfstæðar plöntur). Miðlínan sýnir miðgildið og kassamörkin gefa til kynna 25. og 75. hundraðshluta. Whiskers gefa til kynna lágmarks- og hámarksgildi sem eru ákvörðuð með R hugbúnaði. P gildi voru fengin með tvíhliða t-prófi Welch. g, h Skýringarmynd sem sýnir (g) hvernig á að mæla horn nýja frumuveggsins (magenta) með tilliti til geislastefnu frá miðju SAM (hvít punktalína) (aðeins hnaushornsgildi, þ.e. 0–90°, eru tekin til greina), og (h) ummáls-/hliðar- og geislastefnur innan meristemsins. i Tíðnissúlur af stefnu frumuskiptingarplans þvert á SAM (dökkblátt), IPR (miðblátt) og ekki IPR (ljósblátt), í sömu röð. P gildi voru fengin með tvíhliða Kolmogorov-Smirnov prófi. Tilraunin var endurtekin tvisvar með svipuðum árangri. j Tíðnissúlur af stefnu frumuskiptingarplans IPR umhverfis P3 (ljósgrænt), P4 (miðlungsgrænt) og P5 (dökkgrænt), í sömu röð. P gildi voru fengin með tvíhliða Kolmogorov-Smirnov prófi. Tilraunin var endurtekin tvisvar með svipuðum árangri.
Þess vegna könnuðum við næst fylgni milli GA merkja og frumuskiptavirkni með því að bera kennsl á nýmyndaða frumuveggi meðan á prófuninni stóð (mynd 5e). Þessi nálgun gerði okkur kleift að mæla tíðni og stefnu frumuskiptingar. Furðu komumst við að því að tíðni frumuskipta í IPR og restinni af SAM (ekki IPR, mynd 5f) var svipuð, sem gefur til kynna að munur á GA merkjum milli IPR og non-IPR frumna hafi ekki marktæk áhrif á frumuskiptingu. Þetta, og jákvæð fylgni milli GA merkja og vaxtar anisotropy, varð til þess að við hugleiddum hvort GA merkjavirkni gæti haft áhrif á stefnu frumuskiptaplansins. Við mældum stefnu nýja frumuveggsins sem oddhvass horn miðað við geislaásinn sem tengir meristem miðjuna og miðju nýja frumuveggsins (mynd 5e-i) og sáum skýra tilhneigingu frumna til að skipta sér við horn nálægt 90° miðað við geislaásinn, með hæstu tíðnirnar sem mældust við 8° – 20,0% og 0,80% og 0,8% og 20% (0,20%). (22,62%) (mynd 5e,i), sem samsvarar frumuskiptingu í ummáls-/þverstefnu (mynd 5h). Til að kanna framlag GA merkja til þessa frumuskiptingarhegðun, greindum við frumuskiptingarbreytur í IPR og non-IPR sérstaklega (mynd 5i). Við sáum að skiptingarhornsdreifingin í IPR frumum var frábrugðin því í frumum sem ekki voru IPR eða í frumum í öllu SAM, þar sem IPR frumur sýndu hærra hlutfall hliðar/hringlaga frumuskiptinga, þ.e. 70–80° og 80–90° (33,86% og 30,71%, í sömu röð) (Fig. Þannig leiddu athuganir okkar í ljós tengsl milli mikillar GA merkja og stefnu frumuskiptingarplans nálægt ummálsstefnu, svipað og fylgni milli GA merkjavirkni og vaxtar anisotropy (mynd 5c, d). Til að koma frekar á staðbundinni varðveislu þessa félags, mældum við stefnu skiptingarplans í IPR frumum umhverfis primordium frá P3, þar sem hæsta GA merkjavirkni greindist á þessu svæði frá P4 (mynd 4). Skiptingarhorn IPR í kringum P3 og P4 sýndu engan tölfræðilega marktækan mun, þó að aukin tíðni hliðarfrumuskipta hafi sést í IPR í kringum P4 (mynd 5j). Hins vegar, í IPR frumunum í kringum P5, varð munur á stefnu frumuskiptaplansins tölfræðilega marktækur, með mikilli aukningu á tíðni þverfrumnaskipta (mynd 5j). Saman benda þessar niðurstöður til þess að GA boð geti stjórnað stefnu frumuskipta í SAM, sem er í samræmi við fyrri skýrslur40,41 um að mikil GA boð geti framkallað hliðarstefnu frumuskipta í IPR.
Því er spáð að frumur í IPR verði ekki felldar inn í frumufrumur heldur inn í millifrumur2,42,43. Þverstefna frumuskiptanna í IPR getur leitt til dæmigerðrar skipulags samhliða lengdaröðum húðþekjufrumna í innheimtum. Athuganir okkar sem lýst er hér að ofan benda til þess að GA-merkjasendingar gegni líklega hlutverki í þessu ferli með því að stjórna stefnu frumuskiptingar.
Tap á virkni nokkurra DELLA gena leiðir til myndunar GA svörunar og hægt er að nota della stökkbrigði til að prófa þessa tilgátu44. Við greindum fyrst tjáningarmynstur fimm DELLA gena í SAM. Umritunarsamruni GUS-línunnar45 leiddi í ljós að GAI, RGA, RGL1 og RGL2 (í mun minna mæli) komu fram í SAM (viðbótarmynd 11a–d). In situ blending sýndi ennfremur að GAI mRNA safnast sérstaklega fyrir í frumum og blómum sem eru að þróast (aukamynd 11e). RGL1 og RGL3 mRNA greindust í gegnum SAM tjaldhiminn og í eldri blómum, en RGL2 mRNA var meira á landamærasvæðinu (aukamynd 11f–h). Confocal myndgreining af pRGL3::RGL3-GFP SAM staðfesti tjáninguna sem sést við in situ blending og sýndi að RGL3 prótein safnast fyrir í miðhluta SAM (viðbótarmynd 11i). Með því að nota pRGA::GFP-RGA línuna komumst við einnig að því að RGA prótein safnast fyrir í SAM, en magn þess minnkar við landamærin frá P4 (aukamynd 11j). Athyglisvert er að tjáningarmynstur RGL3 og RGA eru í samræmi við meiri GA merkjavirkni í IPR, eins og greint er með qmRGA (mynd 4). Ennfremur benda þessi gögn til þess að öll DELLA séu gefin upp í SAM og að tjáning þeirra spannar sameiginlega allt SAM.
Næst greindum við frumuskiptingarbreytur í villigerð SAM (Ler, stjórn) og gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della fimmfalda (alþjóðlega) stökkbrigði (mynd 6a, b). Athyglisvert var að við sáum tölfræðilega marktæka breytingu á dreifingu frumuskiptahornstíðni í della alþjóðlegu stökkbreyttu SAM samanborið við villigerðina (mynd 6c). Þessi breyting á della global stökkbreytingunni stafaði af aukinni tíðni 80–90° horna (34,71% á móti 24,55%) og í minna mæli 70–80° horna (23,78% á móti 20,18%), þ.e. samsvarandi þverfrumnaskiptingu (Fig. 6c). Tíðni óþverskiptinga (0–60°) var einnig lægri í della global stökkbrigði (mynd 6c). Tíðni þverfrumnaskipta jókst verulega í SAM á della global stökkbrigði (mynd 6b). Tíðni þverfrumnaskipta í IPR var einnig hærri í della global stökkbrigði samanborið við villigerðina (mynd 6d). Utan IPR-svæðisins hafði villigerðin jafnari dreifingu á frumuskiptingarhornum, en della global stökkbreytti valdi snertiskiptingar eins og IPR (mynd 6e). Við mældum einnig stefnu frumuskiptingar í SAM ga2 oxidasa (ga2ox) fimmfaldra stökkbreyttra (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 og ga2ox6-2), GA-óvirkur stökkbreyttur bakgrunnur þar sem GA safnast fyrir. Í samræmi við aukningu á GA-gildum var SAM fimmfalda ga2ox stökkbreyttu blómablómsins stærra en Col-0 (aukamynd. 12a, b), og samanborið við Col-0 sýndi fimmfalda ga2ox SAM greinilega mismunandi dreifingu frumuskiptahorna, með snertitíðni 9,° aftur í snertihorn 500°. skiptingar (aukamynd 12a–c). Þannig sýnum við að formbundin virkjun GA merkja og GA uppsöfnun framkallar hliðarfrumuskiptingu í IPR og restinni af SAM.
a, b 3D sjónmynd á L1 laginu af PI-lituðu Ler (a) og alþjóðlegu della stökkbreyttu (b) SAM með því að nota confocal smásjá. Nýir frumuveggir sem myndast í SAM (en ekki frumur) á 10 klst. tímabili eru sýndir og litaðir í samræmi við horngildi þeirra. Innfellingin sýnir SAM á 0 klst. Litastikan birtist neðst í hægra horninu. Örin í (b) bendir á dæmi um samræmdar frumuskrár í hinu alþjóðlega della stökkbrigði. Tilraunin var endurtekin tvisvar með svipuðum árangri. ce samanburður á tíðni dreifingu frumuskiptingar plana stefnum í heild SAM (d), IPR (e), og non-IPR (f) milli Ler og global della. P gildi voru fengin með því að nota tvíhliða Kolmogorov-Smirnov próf. f, g 3D sjónmynd af confocal myndum af PI-lituðum SAM af Col-0 (i) og pCUC2::gai-1-VENUS (j) erfðabreyttum plöntum. Spjöld (a, b) sýna nýja frumuveggi (en ekki frumur) sem myndast í SAM innan 10 klst. Tilraunin var endurtekin tvisvar með svipuðum árangri. h–j Samanburður á tíðnidreifingu frumuskiptaplana sem staðsettar eru í öllu SAM (h), IPR (i) og non-IPR (j) milli Col-0 og pCUC2::gai-1-VENUS plantna. P gildi voru fengin með því að nota tvíhliða Kolmogorov-Smirnov próf.
Næst prófuðum við áhrif þess að hindra GA boð sérstaklega í IPR. Í þessu skyni notuðum við cotyledon cup 2 (CUC2) hvata til að knýja fram tjáningu á ríkjandi neikvæðu gai-1 próteini sem var sameinað VENUS (í pCUC2::gai-1-VENUS línunni). Í villigerð SAM knýr CUC2 hvati tjáningu flestra IPR í SAM, þar með talið landamærafrumum, frá P4 og áfram, og svipuð sértæk tjáning sást í pCUC2::gai-1-VENUS plöntum (sjá hér að neðan). Dreifing frumuskiptahorna yfir SAM eða IPR pCUC2::gai-1-VENUS plantna var ekki marktækt frábrugðin villigerðinni, þó óvænt komumst að því að frumur án IPR í þessum plöntum skiptust á hærri tíðni 80–90° (mynd 6f–j).
Því hefur verið haldið fram að stefna frumuskiptingar fari eftir rúmfræði SAM, sérstaklega togstreitu sem myndast af sveigju vefja46. Við spurðum því hvort lögun SAM væri breytt í della global stökkbreyttu og pCUC2::gai-1-VENUS plöntum. Eins og áður hefur verið greint frá12 var stærð della alþjóðlega stökkbreyttu SAM stærri en villigerðarinnar (viðbótarmynd 13a, b, d). In situ blending CLV3 og STM RNA staðfesti meristem stækkun í della stökkbreyttum og sýndi ennfremur hliðarþenslu stofnfrumu sess (aukamynd. 13e, f, h, i). Hins vegar var SAM sveigjan svipuð í báðum arfgerðunum (aukamynd 13k, m, n, p). Við sáum svipaða stærðaraukningu í gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della fjórfalda stökkbrigðinu án breytinga á sveigju samanborið við villigerðina (aukamynd. 13c, d, g, j, l, o, p). Tíðni frumuskiptingarstefnu var einnig fyrir áhrifum í della fjórfalda stökkbrigðinu, en í minna mæli en í della monolithic stökkbrigðinu (aukamynd 12d–f). Þessi skammtaáhrif, ásamt skorti á áhrifum á sveigju, benda til þess að leifar af RGL3 virkni í Della fjórfalda stökkbreyttu takmarki breytingar á frumuskiptingu af völdum taps á DELLA virkni og að breytingar á hliðarfrumuskiptingu eiga sér stað sem svar við breytingum á GA merkjavirkni frekar en breytingum á SAM rúmfræði. Eins og lýst er hér að ofan, keyrir CUC2 hvatarinn IPR tjáningu í SAM frá og með P4 (aukamynd. 14a, b), og öfugt, pCUC2::gai-1-VENUS SAM hafði minni stærð en meiri sveigju (aukamynd. 14c–h). Þessi breyting á pCUC2::gai-1-VENUS SAM formgerð getur leitt til mismunandi dreifingar á vélrænni álagi samanborið við villigerðina, þar sem mikil ummálsspenna byrjar í styttri fjarlægð frá SAM miðju47. Að öðrum kosti geta breytingar á pCUC2::gai-1-VENUS SAM formgerð stafað af breytingum á svæðisbundnum vélrænum eiginleikum af völdum transgenatjáningar48. Í báðum tilfellum gæti þetta að hluta til vegið upp á móti áhrifum breytinga á GA-merkjasendingum með því að auka líkurnar á að frumur skiptist í ummáls-/þverstefnu, sem útskýrir athuganir okkar.
Samanlagt staðfesta gögnin okkar að hærri GA merki gegnir virku hlutverki í hliðarstefnu frumuskiptaplansins í IPR. Þeir sýna einnig að meristem bugða hefur einnig áhrif á stefnu frumuskiptingarplans í IPR.
Þverstefna skiptingarplansins í IPR, vegna mikillar GA merkjavirkni, bendir til þess að GA forskipi geislafrumuskrá í húðþekju innan SAM til að skilgreina frumuskipulagið sem síðar mun finnast í húðþekju. Reyndar voru slíkar frumuskrár oft sýnilegar í SAM myndum af della alþjóðlegum stökkbreyttum (mynd 6b). Þannig, til að kanna frekar þróunarvirkni staðbundins mynsturs GA merkja í SAM, notuðum við tímaskemmdarmyndgreiningu til að greina staðbundið skipulag frumna í IPR í villigerð (Ler og Col-0), della global stökkbrigði og pCUC2::gai-1-VENUS erfðabreyttum plöntum.
Við komumst að því að qmRGA sýndi að GA merkjavirkni í IPR jókst frá P1/P2 og náði hámarki við P4, og þetta mynstur hélst stöðugt með tímanum (mynd 4a–f og viðbótarmynd 8c–f, k). Til að greina staðbundið skipulag frumna í IPR með auknu GA merki, merktum við Ler IPR frumur fyrir ofan og hliðar P4 í samræmi við þroskaörlög þeirra greind 34 klst. eftir fyrstu athugun, þ.e. meira en tvo plasttíma, sem gerir okkur kleift að fylgjast með IPR frumum meðan á frumþroska stendur frá P1/P2 til P4. Við notuðum þrjá mismunandi liti: gult fyrir þær frumur sem voru samþættar í primordium nálægt P4, grænt fyrir þær sem voru í IPR og fjólublátt fyrir þær sem tóku þátt í báðum ferlum (Mynd 7a-c). Á t0 (0 klst) voru 1-2 lög af IPR frumum sýnileg fyrir framan P4 (mynd 7a). Eins og við var að búast, þegar þessar frumur skiptust, gerðu þær það aðallega í gegnum þverskiptaplanið (myndir 7a–c). Svipaðar niðurstöður voru fengnar með því að nota Col-0 SAM (með áherslu á P3, þar sem landamærin brjótast svipað og P4 í Ler), þó að í þessari arfgerð faldi fellingin sem myndast við blómamörkin hraðar IPR frumurnar (mynd 7g-i). Þannig forskipulagir skiptingarmynstur IPR frumna frumurnar í geislamyndaðar raðir, eins og í innheimtum. Skipulag geislamyndaðra raða og staðsetning IPR-frumna á milli líffæra í röð bendir til þess að þessar frumur séu innafæðar.
Hér þróuðum við hlutfallsmælanlega GA merkja lífskynjara, qmRGA, sem gerir magnbundinni kortlagningu á GA merkjavirkni sem stafar af sameinuðum GA og GA viðtakastyrk á sama tíma og lágmarkar truflun á innrænum boðleiðum og veitir þar með upplýsingar um GA virkni á frumustigi. Í þessu skyni smíðuðum við breytt DELLA prótein, mRGA, sem hefur misst hæfileikann til að binda DELLA víxlverkunaraðila en er enn viðkvæmt fyrir GA-framkölluðum próteingreiningu. qmRGA bregst við bæði utanaðkomandi og innrænum breytingum á GA stigum og kraftmiklir skynjunareiginleikar þess gera kleift að meta tímabundnar breytingar á GA merkjavirkni meðan á þróun stendur. qmRGA er líka mjög sveigjanlegt verkfæri þar sem hægt er að aðlaga það að mismunandi vefjum með því að breyta hvata sem notaður er fyrir tjáningu þess (ef nauðsyn krefur) og í ljósi þess að GA merkjaleiðin og PFYRE mótífið er yfir æðafræja, er líklegt að það sé hægt að flytja til annarra tegunda22. Í samræmi við þetta var einnig sýnt fram á að samsvarandi stökkbreyting í hrísgrjónum SLR1 DELLA próteini (HYY497AAA) bælir vaxtarbælandi virkni SLR1 en dregur aðeins úr GA-miðluðu niðurbroti þess, svipað og mRGA23. Sérstaklega sýndu nýlegar rannsóknir á Arabidopsis að ein amínósýrustökkbreyting í PFYRE léninu (S474L) breytti umritunarvirkni RGA án þess að hafa áhrif á getu þess til að hafa samskipti við umritunarþáttafélaga50. Þrátt fyrir að þessi stökkbreyting sé mjög nálægt 3 amínósýruskiptum sem eru til staðar í mRGA, sýna rannsóknir okkar að þessar tvær stökkbreytingar breyta mismunandi eiginleikum DELLA. Þrátt fyrir að flestir samstarfsaðilar umritunarþátta bindist LHR1 og SAW léninu í DELLA26,51, geta sumar varðveittar amínósýrur í PFYRE léninu hjálpað til við að koma á stöðugleika í þessum milliverkunum.
Þróun innanhúss er lykileiginleiki í arkitektúr plantna og aukningu á afrakstur. qmRGA leiddi í ljós meiri GA-merkjavirkni í IPR internode forfrumum. Með því að sameina megindlega myndgreiningu og erfðafræði, sýndum við fram á að GA-merkjamynstur leggja hringlaga/þverskipting frumuskiptinga í SAM húðþekjuna og móta frumuskiptingarskipulagið sem þarf til þróunar innanfruma. Nokkrir eftirlitsaðilar fyrir stefnu frumuskiptingarplans hafa verið auðkennd við þróun52,53. Vinna okkar gefur skýrt dæmi um hvernig GA merkjavirkni stjórnar þessari frumubreytu. DELLA getur haft samskipti við prefolding próteinfléttur41, þannig að GA boð geta stjórnað stefnu frumuskiptingarplans með því að hafa bein áhrif á stefnu cortical microtubule40,41,54,55. Við sýndum óvænt að í SAM var fylgni hærri GA-boðavirkni ekki lenging eða skipting frumna, heldur aðeins vaxtar-anisotropy, sem er í samræmi við bein áhrif GA á stefnu frumuskiptingar í IPR. Hins vegar getum við ekki útilokað að þessi áhrif gætu einnig verið óbein, td miðlað af GA-framkölluðum mýkingu frumuveggsins56. Breytingar á frumuveggjaeiginleikum valda vélrænni streitu57,58, sem getur einnig haft áhrif á stefnu frumuskiptingarplans með því að hafa áhrif á stefnu cortical microtubules39,46,59. Sameinuð áhrif vélrænnar streitu af völdum GA og bein stjórnun á stefnu örpípla af GA geta átt þátt í að búa til sérstakt mynstur frumuskiptingarstefnu í IPR til að skilgreina millifrumur og frekari rannsóknir eru nauðsynlegar til að prófa þessa hugmynd. Að sama skapi hafa fyrri rannsóknir bent á mikilvægi DELLA-víxlverkandi próteina TCP14 og 15 við stjórnun á myndun innanhnúta60,61 og þessir þættir geta miðlað virkni GA ásamt BREVIPEDICELLUS (BP) og PENNYWISE (PNY), sem stjórna þróun innanhnúta og hefur verið sýnt fram á að hafa áhrif á,62 GA merki2. Í ljósi þess að DELLAs hafa samskipti við brassinostera, etýlen, jasmónsýru og abscisic sýru (ABA) boðleiðir63,64 og að þessi hormón geta haft áhrif á stefnu örpípla65, geta áhrif GA á stefnu frumuskiptingar einnig verið miðlað af öðrum hormónum.
Snemma frumurannsóknir sýndu að bæði innra og ytra svæði Arabidopsis SAM eru nauðsynleg til að þroskast innanhnúta2,42. Sú staðreynd að GA stjórnar frumuskiptingu á virkan hátt í innri vefjum12 styður tvöfalda virkni GA við að stjórna meristem og internode stærð í SAM. Mynstur stefnubundinnar frumuskiptingar er einnig þétt stjórnað í innri SAM vefnum og þessi stjórnun er nauðsynleg fyrir stofnvöxt52. Það verður áhugavert að skoða hvort GA gegni einnig hlutverki við að stilla frumuskiptingarplanið í innra SAM skipulagi og samstillir þar með forskrift og þróun internóta innan SAM.
Plöntur voru ræktaðar in vitro í jarðvegi eða 1x Murashige-Skoog (MS) miðli (Duchefa) bætt við 1% súkrósa og 1% agar (Sigma) við staðlaðar aðstæður (16 klst ljós, 22°C), fyrir utan hypocotyl og rótarvöxt tilraunir þar sem plöntur voru ræktaðar á lóðréttum plötum við stöðugt ljós og 22°C. Fyrir nítrattilraunir voru plöntur ræktaðar á breyttum MS æti (bioWORLD planta æti) sem bætt var við nægjanlegu nítrati (0 eða 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-súksínati, 1% súkrósa og 1% A-agar (Sigma) við langan dag.
GID1a cDNA sett inn í pDONR221 var endursamsett með pDONR P4-P1R-pUBQ10 og pDONR P2R-P3-mCherry í pB7m34GW til að mynda pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 DNA sett inn í pDONR221 var sameinað aftur í pB7RWG266 til að mynda p35S:IDD2-RFP. Til að búa til pGID1b::2xmTQ2-GID1b, var 3,9 kb brot fyrir framan GID1b kóðasvæðið og 4,7 kb brot sem innihélt GID1b cDNA (1,3 kb) og terminator (3,4 kb) fyrst magnað með því að nota primerana í viðbótartöflu 43 og síðan í PNRmo-töflu 43. Fisher Scientific) og pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), í sömu röð, og að lokum endursamsett með pDONR221 2xmTQ268 í pGreen 012567 markferjuna með því að nota Gateway klónun. Til að búa til pCUC2::LSSmOrange, var CUC2 stýriröðin (3229 bp andstreymis ATG) fylgt eftir af kóðaröðinni af stórum Stokes-breyttu mOrange (LSSmOrange)69 með N7 kjarnastaðsetningarmerkinu og NOS umritunarstöðvunarstöðinni sett saman inn í pGreen-skila vektor-kanamybin kerfin með því að nota pGreenway fragmenting-veiruna. (Invitrogen). Tvöfaldur plöntuferjan var settur inn í Agrobacterium tumefaciens stofn GV3101 og settur inn í Nicotiana benthamiana lauf með Agrobacterium íferðaraðferð og í Arabidopsis thaliana Col-0 með blómadýfaaðferð, í sömu röð. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry og pCLV3::mCherry-NLS qmRGA voru einangruð frá F3 og F1 afkvæmum viðkomandi krossa, í sömu röð.
RNA in situ blending var framkvæmd á um það bil 1 cm löngum sprotaoddum72, sem var safnað og fest strax í FAA lausn (3,7% formaldehýð, 5% ediksýra, 50% etanól) forkæld í 4°C. Eftir 2 × 15 mín lofttæmismeðferðir var skipt um festiefni og sýni voru ræktuð yfir nótt. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 og RGL3 cDNAs og andsense prober við 3'-UTR þeirra voru mynduð með því að nota primerana sem sýndir eru í viðbótartöflu 3 eins og lýst er af Rosier et al.73. Digoxigenin merktir rannsakar voru ónæmisgreindir með því að nota digoxigenin mótefni (3000-falda þynningu; Roche, vörulistanúmer: 11 093 274 910), og hlutar voru litaðir með 5-bróm-4-klór-3-indólýlfosfati (BCIP, 250-falt diluetBT, trósólníumblúet, 250 sinnum 200-falda þynningu) lausn.
Pósttími: 10-2-2025