Í þessari rannsókn voru örvandi áhrif samsettrar meðferðar ávaxtarstýringar fyrir plönturRannsóknir voru gerðar á áhrifum (2,4-D og kínetín) og járnoxíðnanóagna (Fe₃O₄-NP) á in vitro formgerð og framleiðslu annars stigs umbrotsefna í *Hypericum perforatum* L. Meðferðin sem var best gerð [2,4-D (0,5 mg/L) + kínetín (2 mg/L) + Fe₃O₄-NP (4 mg/L)] bætti vaxtarþætti plantna verulega: hæð plantna jókst um 59,6%, lengd rótar um 114,0%, fjöldi brumpa um 180,0% og ferskþyngd kallus um 198,3% samanborið við samanburðarhópinn. Þessi samsetta meðferð jók einnig endurnýjunarhagkvæmni (50,85%) og jók hypericíninnihald um 66,6%. GC-MS greining leiddi í ljós hátt innihald af hyperosíði, β-patóleni og setýlalkóhóli, sem nam 93,36% af heildarflatarmáli tindsins, en innihald heildarfenóla og flavonoíða jókst um allt að 80,1%. Þessar niðurstöður benda til þess að vaxtarstýringarefni plantna (PGR) og Fe₃O₄ nanóagnir (Fe₃O₄-NP) hafi samverkandi áhrif með því að örva líffæramyndun og uppsöfnun lífvirkra efnasambanda, sem er efnileg stefna til líftæknilegrar umbóta á lækningajurtum.
Jóhannesarjurt (Hypericum perforatum L.), einnig þekkt sem Jóhannesarjurt, er fjölær jurt af ætt Hypericaceae sem hefur efnahagslegt gildi.[1] Möguleg lífvirk efni hennar eru meðal annars náttúruleg tannín, xantón, flóróglúsínól, naftalendíantrón (hýperín og pseudohyperín), flavonoíð, fenólsýrur og ilmkjarnaolíur.[2,3,4] Jóhannesarjurt er hægt að fjölga með hefðbundnum aðferðum; þó takmarkar árstíðabundin sveigjanleiki hefðbundinna aðferða, lítil spírun fræja og næmi fyrir sjúkdómum möguleika hennar á stórfelldri ræktun og stöðugri myndun aukaefna.[1,5,6]
Þannig er vefjaræktun in vitro talin áhrifarík aðferð til að hraða fjölgun plantna, varðveita kímplasmaauðlindir og auka uppskeru lyfjaefna [7, 8]. Vaxtarstýringarefni plantna (PGR) gegna lykilhlutverki í stjórnun formgerðar og eru nauðsynleg fyrir ræktun kallus og heilla lífvera in vitro. Bestun á styrk þeirra og samsetningu er mikilvæg til að ljúka þessum þroskaferlum með góðum árangri [9]. Þess vegna er mikilvægt að skilja viðeigandi samsetningu og styrk stýringa til að bæta vöxt og endurnýjunargetu jóhannesarjurtar (H. perforatum) [10].
Járnoxíð nanóagnir (Fe₃O₄) eru flokkur nanóagna sem hafa verið eða eru í þróun fyrir vefjaræktun. Fe₃O₄ hefur verulega segulmagnaða eiginleika, góða lífsamhæfni og getu til að stuðla að vexti plantna og draga úr umhverfisálagi, þannig að það hefur vakið mikla athygli í hönnun vefjaræktunar. Möguleg notkun þessara nanóagna gæti verið að hámarka in vitro ræktun til að stuðla að frumuskiptingu, bæta næringarefnaupptöku og virkja andoxunarensím [11].
Þótt nanóagnir hafi sýnt góð áhrif á vöxt plantna, eru rannsóknir á samsettri notkun Fe₃O₄ nanóagna og bjartsýni vaxtarstýriefna í *H. perforatum* enn af skornum skammti. Til að brúa þetta þekkingarbil mat þessi rannsókn áhrif samsettra áhrifa þeirra á in vitro formgerð og framleiðslu aukaefna til að veita nýja innsýn í að bæta eiginleika lækningajurta. Þess vegna hefur þessi rannsókn tvö markmið: (1) að hámarka styrk vaxtarstýriefna plantna til að stuðla að myndun kallus, endurnýjun sprota og rótmyndun in vitro; og (2) að meta áhrif Fe₃O₄ nanóagna á vaxtarþætti in vitro. Framtíðaráætlanir fela í sér að meta lifunartíðni endurnýjaðra plantna við aðlögun (in vitro). Gert er ráð fyrir að niðurstöður þessarar rannsóknar muni bæta verulega örfjölgunarhagkvæmni *H. perforatum* og þar með stuðla að sjálfbærri notkun og líftæknilegri notkun þessarar mikilvægu lækningajurtar.
Í þessari rannsókn fengum við laufblöð úr árlegum jóhannesarjurtarplöntum (móðurplöntum) sem ræktaðar voru á vettvangi. Þessar blöð voru notaðar til að hámarka ræktunarskilyrði in vitro. Fyrir ræktun voru laufin skoluð vandlega undir rennandi eimuðu vatni í nokkrar mínútur. Yfirborð blöðanna var síðan sótthreinsað með því að dýfa þeim í 70% etanól í 30 sekúndur og síðan í 1,5% natríumhýpóklórít (NaOCl) lausn sem innihélt nokkra dropa af Tween 20 í 10 mínútur. Að lokum voru blöðin skoluð þrisvar sinnum með dauðhreinsuðu eimuðu vatni áður en þau voru flutt yfir í næsta ræktunarmiðil.
Næstu fjórar vikur voru endurnýjunarbreytur sprotanna mældar, þar á meðal endurnýjunarhraði, fjöldi sprota á hverja plöntu og lengd sprotanna. Þegar endurnýjuðu sprotarnir náðu að minnsta kosti 2 cm lengd voru þeir fluttir í rótarræktunarmiðil sem samanstóð af hálfstyrkri MS-ræktunarmiðli, 0,5 mg/L af indólsmjörsýru (IBA) og 0,3% gúargúmmíi. Rótarræktun hélt áfram í þrjár vikur og á meðan voru rótarhraði, fjöldi róta og lengd róta mæld. Hver meðferð var endurtekin þrisvar sinnum, þar sem 10 plöntur voru ræktaðar í hverri endurtekningu, sem gaf um það bil 30 plöntur í hverri meðferð.
Hæð plantna var mæld í sentimetrum (cm) með reglustiku, frá rót plöntunnar að oddi hæsta blaðsins. Rótarlengd var mæld í millimetrum (mm) strax eftir að spírurnar voru fjarlægðar vandlega og vaxtarefnið fjarlægt. Fjöldi brumpa á hverri plöntu var talinn beint á hverri plöntu. Fjöldi svartra bletta á laufblöðunum, þekktir sem hnútar, var mældur sjónrænt. Talið er að þessir svörtu hnútar séu kirtlar sem innihalda hypericín, eða oxunarbletti, og eru notaðir sem lífeðlisfræðileg vísbending um svörun plöntunnar við meðferð. Eftir að allt vaxtarefnið hafði verið fjarlægt var ferskþyngd spíranna mæld með rafeindavog með nákvæmni upp á milligrömm (mg).
Aðferðin til að reikna út hraða myndunar kallus er sem hér segir: eftir að hafa ræktað plöntur í ræktunarvökva sem inniheldur ýmsa vaxtarstýringar (kínasa, 2,4-D og Fe3O4) í fjórar vikur er fjöldi plöntur sem geta myndað kallus talinn. Formúlan til að reikna út hraða myndunar kallus er sem hér segir:
Hver meðferð var endurtekin þrisvar sinnum og að minnsta kosti 10 plöntur voru skoðaðar í hverri endurtekningu.
Endurnýjunarhraðinn endurspeglar hlutfall kallusvefjar sem lýkur brummyndunarferlinu með góðum árangri eftir myndun kallusvefjar. Þessi vísbending sýnir getu kallusvefjar til að umbreytast í aðgreindan vef og vaxa í ný plöntulíffæri.
Rótarstuðullinn er hlutfall fjölda greina sem geta rótað af heildarfjölda greina. Þessi vísir endurspeglar árangur rótunarstigsins, sem er mikilvægt í örfjölgun og plöntufjölgun, þar sem góð rótmyndun hjálpar plöntum að lifa betur af við vaxtarskilyrði.
Hypericín efnasambönd voru dregin út með 90% metanóli. Fimmtíu mg af þurrkuðu plöntuefni var bætt út í 1 ml af metanóli og hljóðbeitt í 20 mínútur við 30 kHz í ómskoðunarhreinsitæki (gerð A5120-3YJ) við stofuhita í myrkri. Eftir hljóðbeitt var sýnið skilvindt við 6000 snúninga á mínútu í 15 mínútur. Yfirborðsvökvinn var safnað og gleypni hypericíns mæld við 592 nm með Plus-3000 S litrófsmæli samkvæmt aðferð sem lýst er af Conceiçao o.fl. [14].
Flestar meðferðir með vaxtarstýriefnum plantna (PGR) og járnoxíðnanóögnum (Fe₃O₄-NP) ollu ekki myndun svartra hnúta á endurnýjuðum sprotablöðum. Engir hnútar sáust í neinum meðferðum með 0,5 eða 1 mg/L af 2,4-D, 0,5 eða 1 mg/L af kínetíni, eða 1, 2 eða 4 mg/L af járnoxíðnanóögnum. Nokkrar samsetningar sýndu lítilsháttar aukningu á myndun hnúta (en ekki tölfræðilega marktæka) við hærri styrk kínetíns og/eða járnoxíðnanóagna, svo sem samsetning 2,4-D (0,5–2 mg/L) með kínetíni (1–1,5 mg/L) og járnoxíðnanóögnum (2–4 mg/L). Þessar niðurstöður eru sýndar á mynd 2. Svartir hnútar tákna hypericínríka kirtla, bæði náttúrulega fyrirkomandi og gagnlega. Í þessari rannsókn tengdust svartir hnútar aðallega brúnun vefja, sem benti til hagstæðs umhverfis fyrir uppsöfnun hypericíns. Meðferð með 2,4-D, kinetíni og Fe₃O₄ nanóögnum jók vöxt kallus, minnkaði brúnun og jók blaðgrænuinnihald, sem bendir til bættrar efnaskiptavirkni og hugsanlegrar minnkunar á oxunarskemmdum [37]. Þessi rannsókn mat áhrif kinetíns í samsetningu við 2,4-D og Fe₃O₄ nanóögnir á vöxt og þroska jóhannesarjurtarkallus (Mynd 3a–g). Fyrri rannsóknir hafa sýnt að Fe₃O₄ nanóagnir hafa sveppadrepandi og örverueyðandi virkni [38, 39] og þegar þær eru notaðar í samsetningu við vaxtarstýringar plantna geta þær örvað varnarkerfi plantna og dregið úr frumuálagi [18]. Þó að lífefnamyndun annars stigs umbrotsefna sé erfðafræðilega stjórnað, er raunveruleg uppskera þeirra mjög háð umhverfisaðstæðum. Efnaskipta- og formfræðilegar breytingar geta haft áhrif á magn annars stigs umbrotsefna með því að stjórna tjáningu tiltekinna plantnagena og bregðast við umhverfisþáttum. Þar að auki geta örvar virkjað nýrra gena, sem aftur örva ensímvirkni, sem að lokum virkjar margar lífefnafræðilegar leiðir og leiðir til myndunar annars stigs umbrotsefna. Ennfremur sýndi önnur rannsókn að minnkuð skugga eykur sólarljós og hækkar þannig daghita í náttúrulegu umhverfi *Hypericum perforatum*, sem einnig stuðlar að aukinni uppskeru hypericíns. Byggt á þessum gögnum rannsakaði þessi rannsókn hlutverk járnnanóagna sem hugsanlegra örva í vefjaræktun. Niðurstöðurnar sýndu að þessar nanóagnir geta virkjað gen sem taka þátt í hesperidínmyndun með ensímörvun, sem leiðir til aukinnar uppsöfnunar þessa efnasambands (Mynd 2). Því má, samanborið við plöntur sem vaxa við náttúrulegar aðstæður, færa rök fyrir því að framleiðsla slíkra efnasambanda in vivo geti einnig aukist þegar miðlungs streita er sameinuð virkjun gena sem taka þátt í myndun annars stigs umbrotsefna. Samsetningarmeðferðir hafa almennt jákvæð áhrif á endurnýjunarhraða, en í sumum tilfellum veikjast þessi áhrif. Athyglisvert er að meðferð með 1 mg/L af 2,4-D, 1,5 mg/L af kínasa og mismunandi styrkjum gat sjálfstætt og marktækt aukið endurnýjunarhraða um 50,85% samanborið við samanburðarhópinn (Mynd 4c). Þessar niðurstöður benda til þess að sérstakar samsetningar nanóhormóna geti virkað samverkandi til að stuðla að vexti plantna og framleiðslu umbrotsefna, sem er mjög mikilvægt fyrir vefjaræktun lækningajurta. Palmer og Keller [50] sýndu fram á að 2,4-D meðferð gat sjálfstætt örvað myndun kallus í St. perforatum, en viðbót kínasa jók verulega myndun og endurnýjun kallus. Þessi áhrif voru vegna bætts hormónajafnvægis og örvunar frumuskiptingar. Bal o.fl. [51] komust að því að meðferð með Fe₃O₄-NP gat sjálfstætt aukið virkni andoxunarensíma og þar með stuðlað að rótarvexti í St. perforatum. Ræktunarmiðill sem innihélt Fe₃O₄ nanóagnir í styrk 0,5 mg/L, 1 mg/L og 1,5 mg/L bætti endurnýjunarhraða hörplantna [52]. Notkun kínetíns, 2,4-díklórbensótíasólínóns og Fe₃O₄ nanóagna jók verulega myndunarhraða kallus og rótar, en þó þarf að hafa í huga hugsanlegar aukaverkanir af notkun þessara hormóna til endurnýjunar in vitro. Til dæmis getur langtíma eða mikil notkun 2,4-díklórbensótíasólínóns eða kínetíns leitt til klónafrávika í líkamanum, oxunarálags, óeðlilegrar formgerðar kallus eða glermyndunar. Þess vegna spáir hár endurnýjunarhraði ekki endilega fyrir um erfðafræðilegan stöðugleika. Meta ætti allar endurnýjaðar plöntur með sameindamerkjum (t.d. RAPD, ISSR, AFLP) eða frumufræðilegri greiningu til að ákvarða einsleitni þeirra og líkindi við plöntur in vivo [53,54,55].
Þessi rannsókn sýndi í fyrsta skipti fram á að samsett notkun vaxtarstýriefna plantna (2,4-D og kínetíns) með Fe₃O₄ nanóögnum getur aukið formgerð og uppsöfnun lykillífvirkra umbrotsefna (þar á meðal hypericíns og hyperósíðs) í *Hypericum perforatum*. Bætt meðferðaráætlun (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L kínetín + 4 mg/L Fe₃O₄-NPs) hámarkaði ekki aðeins myndun kallus, líffæramyndun og uppskeru aukaumbrotsefna heldur sýndi einnig væg örvandi áhrif, sem hugsanlega bætir streituþol plöntunnar og lækningalegt gildi. Samsetning nanótækni og vefjaræktunar plantna veitir sjálfbæran og skilvirkan vettvang fyrir stórfellda in vitro framleiðslu á lyfjaefnum. Þessar niðurstöður ryðja brautina fyrir iðnaðarnotkun og framtíðarrannsóknir á sameindaferlum, skammtabestun og erfðafræðilegri nákvæmni, og tengja þannig grundvallarrannsóknir á lækningajurtum við hagnýta líftækni.
Birtingartími: 12. des. 2025