Ormalyfið N,N-díetýl-m-tólúamíð (DEET) hefur verið greint frá því að það hamli AChE (asetýlkólínesterasa) og hafi hugsanlega krabbameinsvaldandi eiginleika vegna of mikillar æðamyndunar. Í þessari grein sýnum við að DEET örvar æðaþelsfrumur sérstaklega sem stuðla að æðamyndun og eykur þar með æxlisvöxt. DEET virkjar frumuferli sem leiða til æðamyndunar, þar með talið fjölgun, flæði og viðloðun. Þetta tengist aukinni NO framleiðslu og VEGF tjáningu í æðaþelsfrumum. Þöggun á M3 eða notkun lyfjafræðilegra M3-hemla afmáði öll þessi áhrif, sem bendir til þess að DEET-framkallað æðamyndun sé M3-næm. Tilraunir sem fela í sér kalsíumboð í æðaþels- og HEK-frumum sem oftjáa M3 viðtaka, sem og bindingar- og tengirannsóknir, benda til þess að DEET virki sem allosteric modulator M3-viðtaka. Ennfremur hamlar DEET AChE og eykur þar með aðgengi asetýlkólíns og bindingu þess við M3 viðtaka og eykur foræðaáhrif með allósterískri stjórnun.
Aðal EC voru einangruð úr ósæði svissneskra músa. Útdráttaraðferðin var aðlöguð frá Kobayashi siðareglunum 26. Murine ECs voru ræktaðir í EBM-2 miðli sem bætt var við 5% hitaóvirkjuð FBS þar til í fjórðu leiðinni.
Áhrif tveggja styrkleika DEET á útbreiðslu HUVEC, U87MG eða BF16F10 voru greind með CyQUANT frumufjölgunargreiningarsettinu (Molecular Probes, C7026). Í stuttu máli voru 5.103 frumur í hverri brunn sáð í 96-brunn plötu, leyft að festast yfir nótt og síðan meðhöndluð með DEET í 24 klst. Eftir að vaxtarmiðillinn hefur verið fjarlægður, bætið litarbindilausn við hvern brunn á örplötunni og ræktið frumurnar við 37 °C í 30 mínútur. Flúrljómunarmagn voru ákvörðuð með Mithras LB940 multimode örplötulesara (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Þýskalandi) búinn 485 nm örvunarsíur og 530 nm útblásturssíur.
HUVEC var sáð í 96 brunna plötur með þéttleika 104 frumna í hverri brunn. Frumur voru meðhöndlaðar með DEET í 24 klst. Lífvænleiki frumna var metinn með litamælingu MTT prófi (Sigma-Aldrich, M5655). Ljósþéttnigildi voru fengin á multimode örplötulesara (Mithras LB940) við bylgjulengd 570 nm.
Áhrif DEET voru rannsökuð með því að nota in vitro æðamyndunarpróf. Meðferð með 10-8 M eða 10-5 M DEET jók myndun háræðalengdar í HUVEC (mynd 1a, b, hvítar súlur). Í samanburði við samanburðarhópinn sýndi meðferð með DEET styrk á bilinu 10-14 til 10-5 M að háræðalengdin náði hásléttu við 10-8 M DEET (viðbótarmynd S2). Enginn marktækur munur fannst á in vitro forverandi áhrifum HUVECs sem voru meðhöndlaðir með DEET á styrkleikabilinu 10-8 M og 10-5 M.
Til að ákvarða áhrif DEET á nýæðamyndun, gerðum við in vivo nýæðavæðingarrannsóknir. Eftir 14 daga sýndu mýs sem voru sprautaðar með æðaþelsfrumum forræktaðar með 10-8 M eða 10-5 M DEET marktæka aukningu á blóðrauðainnihaldi (mynd 1c, hvítar súlur).
Ennfremur var DEET-framkallað nýæðamyndun rannsökuð hjá U87MG xenograft-berum músum sem voru sprautaðar daglega (ip) með DEET í skammti sem vitað er að framkallar plasmaþéttni upp á 10-5 M, sem er eðlilegt hjá mönnum sem verða fyrir áhrifum. í 23. Greinaleg æxli (þ.e. æxli >100 mm3) sáust 14 dögum eftir inndælingu U87MG frumna í mýs. Á degi 28 var æxlisvöxtur aukinn marktækt í DEET-meðhöndluðum músum samanborið við viðmiðunarmús (mynd 1d, ferningur). Ennfremur sýndi CD31 litun á æxlum að DEET jók háræðasvæði marktækt en ekki þéttleika öræða. (Mynd 1e–g).
Til að ákvarða hlutverk múskarínviðtaka í DETA-framkallaðri fjölgun, var notað 10-8 M eða 10-5 M DETA í viðurvist pFHHSiD (10-7 M, sértækur M3 viðtakablokki). Meðferð við HUVEC. pFHHSiD lokaði algjörlega fjölgunareiginleikum DETA í öllum styrkjum (tafla 1).
Við þessar aðstæður skoðuðum við einnig hvort DEET myndi auka háræðalengd í HUVEC frumum. Á sama hátt kom pFHHSiD marktækt í veg fyrir DEET-framkallaða háræðalengd (mynd 1a, b, gráar súlur). Ennfremur voru svipaðar tilraunir gerðar með M3 siRNA. Þrátt fyrir að viðmiðunar siRNA hafi ekki verið árangursríkt við að stuðla að háræðsmyndun, afnam þöggun M3 múskarínviðtaka getu DEET til að auka lengd háræða (mynd 1a, b, svartar súlur).
Ennfremur voru bæði 10-8 M eða 10-5 M DEET framkölluð æðamyndun in vitro og nýæðamyndun in vivo algjörlega læst af pFHHSiD (mynd 1c, d, hringir). Þessar niðurstöður benda til þess að DEET ýti undir æðamyndun í gegnum braut sem er næm fyrir sértækum M3 viðtaka mótlyfjum eða M3 siRNA.
AChE er sameindamarkmið DEET. Lyf eins og donepezil, sem virka sem AChE hemlar, geta örvað EC æðamyndun in vitro og í blóðþurrðarlíkönum í afturútlimum músa14. Við prófuðum áhrif tveggja styrks DEET á AChE ensímvirkni í HUVEC. Lágur (10-8 M) og hár (10-5 M) styrkur DEET dró úr virkni æðaþels AChE samanborið við viðmiðunaraðstæður (mynd 2).
Bæði styrkur DEET (10-8 M og 10-5 M) dró úr acetýlkólínesterasavirkni á HUVEC. BW284c51 (10-5 M) var notað sem viðmiðun fyrir asetýlkólínesterasahemla. Niðurstöður eru gefnar upp sem hlutfall af AChE virkni á HUVEC sem var meðhöndlað með tveimur styrkjum DEET samanborið við frumur sem fengu burðarefni. Gildi eru gefin upp sem meðaltal ± SEM sex óháðra tilrauna. *p < 0,05 miðað við samanburðarpróf (Kruskal-Wallis og Dunn margfeldis samanburðarpróf).
Nituroxíð (NO) tekur þátt í æðamyndunarferlinu 33, þess vegna var NO framleiðsla í DEET-örvuðum HUVECs rannsökuð. DEET-meðhöndlaða NO framleiðsla æðaþels var aukin samanborið við viðmiðunarfrumur, en náði aðeins þýðingu við 10-8 M skammt (mynd 3c). Til að ákvarða sameindabreytingar sem stjórna DEET-framkölluðum NO framleiðslu, var eNOS tjáning og virkjun greind með Western blotting. Þrátt fyrir að DEET meðferð hafi ekki breytt eNOS tjáningu, jók hún marktækt eNOS fosfórun á virkjunarstað þess (Ser-1177) en minnkaði hindrunarstað þess (Thr-495) samanborið við ómeðhöndlaðar frumur í eNOS fosfórun (mynd 3d). Ennfremur var hlutfall fosfórýleraðs eNOS á virkjunarstað og hindrunarstað reiknað eftir að hafa staðlað magn fosfórýleraðs eNOS við heildarmagn ensíms. Þetta hlutfall var marktækt aukið í HUVEC sem voru meðhöndluð með hverjum styrk DEET samanborið við ómeðhöndlaðar frumur (mynd 3d).
Að lokum var tjáning VEGF, sem er einn helsti foræðavaldandi þátturinn, greind með Western blotting. DEET jók marktækt VEGF tjáningu, en pFHHSiD lokaði algjörlega fyrir þessa tjáningu.
Þar sem áhrif DEET eru næm fyrir bæði lyfjafræðilegri blokkun og niðurstjórnun M3 viðtaka, prófuðum við tilgátuna um að DEET gæti aukið kalsíumboð. Furðu, DEET tókst ekki að auka umfrymiskalsíum í HUVEC (gögn ekki sýnd) og HEK/M3 (mynd 4a, b) fyrir báða styrkleika sem notaðir voru.
Birtingartími: 30. desember 2024