Ormalyfið N,N-díetýl-m-tólúamíð (DEET) hefur reynst hamla AChE (asetýlkólínesterasa) og hefur hugsanlega krabbameinsvaldandi eiginleika vegna óhóflegrar æðamyndunar. Í þessari grein sýnum við fram á að DEET örvar sérstaklega æðaþelsfrumur sem stuðla að æðamyndun og eykur þannig æxlisvöxt. DEET virkjar frumuferli sem leiða til æðamyndunar, þar á meðal fjölgun, flutning og viðloðun. Þetta tengist aukinni NO framleiðslu og VEGF tjáningu í æðaþelsfrumum. Þöggun M3 eða notkun lyfjafræðilegra M3 hemla útilokaði öll þessi áhrif, sem bendir til þess að DEET-völd æðamyndun sé M3-næm. Tilraunir sem fela í sér kalsíumboð í æðaþelsfrumum og HEK frumum sem ofurtjá M3 viðtaka, sem og rannsóknir á bindingu og tengingu, benda til þess að DEET virkar sem allósterískur mótandi á M3 viðtaka. Ennfremur hamlar DEET AChE og eykur þannig aðgengi asetýlkólíns og bindingu þess við M3 viðtaka og eykur æðamyndunaráhrif í gegnum allósteríska stjórnun.
Aðal EC-frumur voru einangraðar úr ósæð svissneskra músa. Útdráttaraðferðin var aðlöguð frá Kobayashi-samskiptareglunni 26. Músa-EC-frumur voru ræktaðar í EBM-2 miðli bætt við 5% hitaóvirkjuðu FBS þar til fjórða umferðin fór fram.
Áhrif tveggja styrkleika af DEET á fjölgun HUVEC, U87MG eða BF16F10 voru greind með CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Í stuttu máli voru 5.103 frumur í hverjum brunni sáðar í 96-brunna plötu, látin festast yfir nótt og síðan meðhöndlaðar með DEET í 24 klst. Eftir að vaxtarmiðillinn hefur verið fjarlægður, bætt er litarefnisbindandi lausn við hvert brunn örplötunnar og frumurnar ræktaðar við 37°C í 30 mínútur. Flúrljómunarstig voru ákvörðuð með Mithras LB940 fjölstillingar örplötulesara (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Þýskalandi) búinn 485 nm örvunarsíum og 530 nm útblásturssíum.
HUVEC voru sáð í 96 hols plötur með þéttleikanum 104 frumur í hverjum holi. Frumurnar voru meðhöndlaðar með DEET í 24 klst. Lífvænleiki frumna var metinn með litrófsmælingu á MTT prófi (Sigma-Aldrich, M5655). Ljósþéttleikagildi voru mæld með fjölþátta örplötulesara (Mithras LB940) við bylgjulengdina 570 nm.
Áhrif DEET voru rannsökuð með in vitro æðamyndunarprófum. Meðferð með 10-8 M eða 10-5 M DEET jók myndun háræðalengdar í HUVEC (Mynd 1a, b, hvítir súlur). Í samanburði við samanburðarhópinn sýndi meðferð með DEET styrk á bilinu 10-14 til 10-5 M að háræðalengdin náði jafnvægi við 10-8 M DEET (Viðbótarmynd S2). Enginn marktækur munur fannst á in vitro æðamyndunaráhrifum HUVEC meðhöndlaðra með DEET á styrkbilinu 10-8 M og 10-5 M.
Til að ákvarða áhrif DEET á nýæðamyndun framkvæmdum við in vivo rannsóknir á nýæðamyndun. Eftir 14 daga sýndu mýs sem höfðu fengið innspýtingar í æðaþelsfrumur sem höfðu verið forræktaðar með 10-8 M eða 10-5 M DEET marktæka aukningu á blóðrauðainnihaldi (Mynd 1c, hvítar súlur).
Ennfremur var DEET-framkölluð nýæðamyndun rannsökuð í U87MG músum með ígræðslu sem fengu sprautu daglega (ip) með DEET í skammti sem vitað er að veldur plasmaþéttni 10-5 M, sem er eðlilegt hjá mönnum sem hafa orðið fyrir áhrifum. í 23. Greinanleg æxli (þ.e. æxli >100 mm3) sáust 14 dögum eftir inndælingu U87MG frumna í mýs. Á degi 28 var æxlisvöxtur marktækt aukinn í DEET-meðhöndluðum músum samanborið við samanburðarmýs (Mynd 1d, ferningar). Ennfremur sýndi CD31 litun æxla að DEET jók verulega háræðaflatarmál en ekki þéttleika öræða. (Mynd 1e-g).
Til að ákvarða hlutverk múskarínviðtaka í DETA-örvuðum fjölgun var notað 10-8 M eða 10-5 M DETA í viðurvist pFHHSiD (10-7 M, sértækur M3 viðtakablokki). Meðferð við HUVEC. pFHHSiD blokkaði algerlega fjölgunareiginleika DETA í öllum styrkleikum (Tafla 1).
Við þessar aðstæður skoðuðum við einnig hvort DEET myndi auka háræðalengd í HUVEC frumum. Á sama hátt kom pFHHSiD marktækt í veg fyrir DEET-örvaða háræðalengd (Mynd 1a, b, gráir súlur). Ennfremur voru svipaðar tilraunir gerðar með M3 siRNA. Þó að samanburðar siRNA væri ekki áhrifaríkt við að stuðla að háræðamyndun, þá útilokaði þöggun M3 múskarínviðtakans getu DEET til að auka háræðalengd (Mynd 1a, b, svartir súlur).
Ennfremur var bæði æðamyndun in vitro og nýæðamyndun in vivo, sem var framkölluð af 10-8 M eða 10-5 M DEET, algjörlega hindruð af pFHHSiD (Mynd 1c, d, hringir). Þessar niðurstöður benda til þess að DEET stuðli að æðamyndun í gegnum ferli sem er næmt fyrir sértækum M3 viðtakablokkum eða M3 siRNA.
AChE er sameindamarkmið DEET. Lyf eins og dónepezíl, sem virka sem AChE-hemlar, geta örvað æðamyndun í endocrine rectum in vitro og í blóðþurrðarlíkönum í afturfótum músa14. Við prófuðum áhrif tveggja styrkja af DEET á virkni AChE ensíma í HUVEC. Lágt (10-8 M) og hátt (10-5 M) magn af DEET minnkaði virkni AChE í æðaþelsfrumum samanborið við samanburðarhóp (Mynd 2).
Báðar styrkleikar DEET (10-8 M og 10-5 M) drógu úr asetýlkólínesterasa virkni á HUVEC. BW284c51 (10-5 M) var notað sem samanburðarpróf fyrir asetýlkólínesterasahemla. Niðurstöður eru gefnar upp sem hlutfall af AChE virkni á HUVEC sem meðhöndlað var með tveimur styrkleikum DEET samanborið við frumur sem meðhöndlaðar voru með burðarefni. Gildi eru gefin upp sem meðaltal ± staðalfrávik úr sex óháðum tilraunum. *p < 0,05 samanborið við samanburðarpróf (Kruskal-Wallis og Dunn margfeldis samanburðarpróf).
Nituroxíð (NO) tekur þátt í æðamyndunarferlinu 33, þess vegna var NO framleiðsla í DEET-örvuðum HUVEC frumum rannsökuð. DEET-meðhöndluð NO framleiðsla í æðaþelsfrumum jókst samanborið við samanburðarfrumur, en náði aðeins marktækri þýðingu við skammt upp á 10-8 M (Mynd 3c). Til að ákvarða sameindabreytingar sem stjórna DEET-örvuðum NO framleiðslu, var eNOS tjáning og virkjun greind með Western blotting. Þó að DEET meðferð breytti ekki eNOS tjáningu, jók hún marktækt eNOS fosfórun á virkjunarstað þess (Ser-1177) en minnkaði hömlunarstað þess (Thr-495) samanborið við ómeðhöndlaðar frumur í eNOS fosfórun (Mynd 3d). Ennfremur var hlutfall fosfórýleraðs eNOS á virkjunarstað og hömlunarstað reiknað eftir að magn fosfórýleraðs eNOS miðað við heildarmagn ensíms hafði verið staðlað. Þetta hlutfall jókst marktækt í HUVEC frumum sem meðhöndlaðar voru með hverjum styrk af DEET samanborið við ómeðhöndlaðar frumur (Mynd 3d).
Að lokum var tjáning VEGF, eins helsta æðamyndunarþáttarins, greind með Western blotting. DEET jók marktækt tjáningu VEGF en pFHHSiD blokkaði þessa tjáningu alveg.
Þar sem áhrif DEET eru næm fyrir bæði lyfjafræðilegri hindrun og niðurstýringu á M3 viðtökum, prófuðum við þá tilgátu að DEET gæti aukið kalsíumboð. Óvænt sýndi DEET ekki aukið kalsíum í umfrymi í HUVEC (gögn ekki sýnd) og HEK/M3 (mynd 4a, b) fyrir báða styrkleika sem notaðir voru.
Birtingartími: 30. des. 2024