Skordýraeitur gegna lykilhlutverki í að takast á við alþjóðlegan matvælaskort og berjast gegn sjúkdómum sem berast með vektorum hjá mönnum. Hins vegar krefst vaxandi vandamál skordýraeiturþols brýnnar uppgötvunar nýrra efnasambanda sem miða á vannýtt skotmörk. Skammvinnir skordýraeitursviðtakarásir (TRPV) - Nanzhong (Nan) og óvirkir (Iav) - geta myndað ólíkar rásir (Nan-Iav) og staðbundið sig í skynjunarlíffærum sem miðla jarðfræðilegri spennu, heyrn og stöðuskynjun hjá skordýrum. Sum skordýraeitur, eins og aphidopyrrolidone (AP), miða á Nan-Iav með óþekktum aðferðum. AP er áhrifaríkt gegn stingandi skordýrum (hemipteran) og kemur í veg fyrir fæðuöflun með því að trufla virkni þráðanna. AP getur aðeins bundist Nan, en aðeins Nan-Iav getur haft samskipti við örva, þar á meðal innrænt nikótínamíð (NAM), og þannig sýnt rásarvirkni. Þrátt fyrir möguleika Nan-Iav sem skordýraeitursmarkmið er lítið vitað um rásarsamsetningu þess, bindistaði stjórnunar og Ca2+-háða stjórnun, sem hindrar frekari þróun skordýraeiturs. Í þessari rannsókn var frystingarrafeindasmásjá notuð til að ákvarða uppbyggingu Nan-Iav í Hemiptera skordýrum í kalmodulín-lígand-fríu ástandi, sem og með AP og NAM á mörkum ankyrin repeat cytoplasmic domain (ARD). Óvænt komumst við að því að Nan próteinið sjálft getur myndað fimmhyrning, sem er stöðugað með AP-miðlaðri ARD-víxlverkun. Þessi rannsókn leiðir í ljós sameindavíxlverkanir milli skordýraeiturs og örva og Nan-Iav, sem undirstrikar mikilvægi ARD í starfsemi og samsetningu rása og kannar verkunarháttur Ca2+ stjórnunar.
Í ljósi sífellt alvarlegri loftslagsbreytinga á heimsvísu er versnandi matvælaöryggi á heimsvísu ein af helstu áskorunum 21. aldarinnar, með víðtækum afleiðingum fyrir samfélagið.1,2Í skýrslu Alþjóðaheilbrigðismálastofnunarinnar, stöðu matvælaöryggis og næringar í heiminum árið 2023 (SOFI), er áætlað að um það bil 2,33 milljarðar manna um allan heim þjáist af miðlungs til alvarlegu matvælaóöryggi, sem er langvarandi vandamál.3,4Því miður er áætlað að um 20% til 30% eða meira af uppskeru tapist árlega vegna meindýra og sýkla, og búist er við að hlýnun jarðar muni auka viðnám meindýra og viðkvæmni uppskeru.4, 5, 6, 7, 8Þróun skordýraeiturs er mikilvæg, ekki aðeins til að vernda uppskeru gegn meindýrum og draga úr útbreiðslu sýkla sem berast með vektorum, heldur einnig til að berjast gegn sjúkdómum sem berast með vektorum hjá mönnum eins og dengue-sótt, malaríu og Chagas-sjúkdómi, sem eru sífellt ónæmari fyrir skordýraeitri.5,9,10,11
Meðal helstu skotmarka taugaeiturs skordýraeiturs er heterotetrameríski TRPV-rásin Nanchung (Nan)-óvirk (Iav) flokkur skordýraeiturs sem uppgötvaðist aðeins á síðasta áratug, þar á meðal skordýraeitur sem fást á markaði eins og imídaklópríð og pýraklóstróbín.12,13,14Hálftilbúna skordýraeitrið aphidopyrrolifen (AP) er nýlega þróuð og markaðssett vara þar sem aðalþátturinn er virka skordýraeitrið Inscalis®, sem binst AP á undirnanómólar virknistigi.15AP sýnir litla bráðaeitrun fyrir frævunardýr, gagnleg skordýr og aðrar lífverur sem ekki eru markhópar, og þegar það er notað samkvæmt leiðbeiningum á merkimiða getur það dregið úr ónæmisþrýstingi gegn öðrum skordýraeitri.16,17,18Nan og Iav eru víða dreifð meðal skordýrategunda, eru aðeins tjáð saman í strengjateygjuviðtökum í loftnetum og útlimum og eru mikilvæg fyrir heyrn, þyngdaraflsskynjun og stöðuskynjun.13, 16, 19, 20, 21, 22AP, imídaklópríð og pýraklóstróbín örva Nan-Iav fléttuna með einstökum verkunarmáta og hindra að lokum boðleiðni í stöðuvökva.13,16,23Hjá skordýrum sem sjúga (hemipterans) eins og blaðlús og hvítflugum skerðir stöðuskynjun þeirra fæðuöflun, sem að lokum leiðir til dauða.13,24Athyglisvert er að AP sýnir mikla sækni í Nan-Iav fléttuna en litla sækni í Nan eitt og sér. Binding AP við Nan-Iav veldur rafstraumi, en binding við Nan eitt og sér örvar ekki virkni rásanna. Iav sjálft binst alls ekki AP.16Þetta bendir til þess að Nan og Iav geti tengst og myndað mismunandi Nan-Iav rásarfléttur (t.d. með mismunandi steikíómetrískum hlutföllum eða mismunandi uppröðun innan sama steikíómetríska hlutfalls) eða að AP geti tengst mörgum stöðum. Ennfremur binst náttúrulega örvandi efnið nikótínamíð (NAM) við Drosophila Nan-Iav með míkrómólsækni og sýnir svipuð áhrif og hjá blaðlúsum (AP) in vitro.16,25og hindrar æxlun og fæðuöflun blaðlúsa, sem að lokum leiðir til dauða þeirra25,26Þessi gögn vekja upp margar spurningar. Til dæmis er enn óljóst hvernig Nan-Iav tvíliðan myndast, hvaða bindistaðir eru notaðir til að stjórna litlum sameindum og hvernig þessar litlu sameindir stjórna rásarvirkni með því að bæla stöðuskynjun. Ennfremur eru ástæðurnar fyrir því að Nan sjálft er óvirkt og hefur litla sækni í AP, en Nan-Iav tvíliðan er virk og bindur AP með meiri sækni, enn óljósar. Að lokum er lítið vitað um Ca2+-háða stjórnun á Nan-Iav virkni og hvernig hún er samþætt taugaboðferlum.. 13,21
Í þessari rannsókn, þar sem við sameinuðum frystingar-rafeindasmásjá, rafgreiningu og geislavirka bindingartækni, könnuðum við samsetningu Nan-Iav og hvernig það bindist við smásameindastjórnendur. Ennfremur greindum við kalmódúlín (CaM) sem er stöðugt bundið við Iav og AP-stöðug Nan pentamera. Þessar niðurstöður veita mikilvæga innsýn í stjórnun kalsíumjóna í rásum, samsetningu rásanna og þá þætti sem ákvarða bindingarskyldu. Mikilvægara er að við staðfestum að ARD gegnir lykilhlutverki í þessum ferlum. Rannsókn okkar á heildstæðum skordýrarásum sem eru bundnar viðeigandi landbúnaðarvarnarefnum.27, 28, 29opnar möguleika fyrir þróun skordýraeitursiðnaðarins, bætir virkni og sértækni skordýraeiturs og gerir kleift að nota efnasambönd sem beinast að TRPV á aðrar tegundir til að takast á við alþjóðlegt fæðuöryggi og útbreiðslu vektorbornra sjúkdóma.
Við komumst einnig að því að Nan-Iav er stjórnað af Ca2+ og að stjórnunarferlið er miðlað af stöðugt bundnu CaM. Mikilvægt er að hafa í huga að þessi Ca2+-háða stjórnun á Nav með CaM er verulega frábrugðin stjórnunarferlum annarra jónagana (t.d. spennustýrðra Na+ rásir og TRPV5/6 rásir).52, 53, 54, 55, 56, 57Í Nav1.2 rásinni tengist C-enda lénið á CaM helix við C-enda lénið (CTD) og Ca2+ örvar bindingu N-enda lénsins við neðsta hluta CTD.56Í TRPV5/6 rásinni binst C-enda lénið á CaM við CTH og Ca2+ veldur uppávið framlengingu N-enda lénsins inn í svitaholuna og hindrar þannig gegndræpi katjóna.53,54Við leggjum til líkan fyrir Ca2+-stýrða virkni Nan-Iav-CaM (Mynd 4h). Í þessu líkani binst N-enda lénið á CaM stöðugt við C-enda lénið (CTH) á Iav. Í hvíldarástandi (lágt [Ca2+] styrk) hefur C-enda lénið á CaM samskipti við Nan, sem stöðugar ARD-byggingu og stuðlar þannig að opnun rásanna. Binding örva/skordýraeiturs við rásina veldur opnun pora, sem leiðir til Ca2+ innstreymis. Ca2+ binst síðan við CaM, sem veldur sundrun C-enda lénsins frá ARD á Nan. Þar sem hindrun á CaM-bindingu afnemur í raun hömlunaráhrif Ca2+, hefur þessi sundrun áhrif á hreyfanleika ARD, sem veldur Ca2+-háðri hömlun eða minnkun næmingar. Hröð endurheimt rásarstrauma eftir kalsíumjónaútskiljun (Mynd 4g) bendir til þess að þessi aðferð auðveldi hröð svörun við Ca2+-miðluðum taugaboðum. Þar að auki hefur verið greint frá því að C-enda svæðið á Iav, sem er enn illa skilið, gegni öðrum hlutverkum í miðun rása og núverandi stjórnun.21
Að lokum kynnir rannsókn okkar hágæða uppbyggingu TRP göngufléttu skordýraeiturs og skordýraeiturs sem hefur þýðingu í landbúnaði — uppgötvun sem við höfðum áður ekki þekkt. Athyglisvert er að við greindum uppbyggingu og virkni skordýraganganna í frumum manna (HEK293S GnTi–) frekar en í skordýrafrumum. Í ljósi vaxandi ónæmis gegn skordýraeitri og áframhaldandi þrýstings á matvælaöryggi og sýkla veitir vinna okkar mikilvægar upplýsingar sem munu auðvelda þróun nýrra skordýraeiturs til hagsbóta fyrir heilsu manna og alþjóðlegt matvælaöryggi. Rannsóknir hafa sýnt að skordýraeitur eins og AP eru áhrifarík gegn sumum meindýrum þegar þau eru notuð samkvæmt leiðbeiningum á merkimiða og hafa lága bráðaeituráhrif á gagnlega frævunardýr, sem sýnir fram á umhverfisöryggi þeirra.13,16Þar að auki hefur verið sýnt fram á að prófanir á sumum afleiðum af AP á moskítóflugum hafa sýnt að þær missa að lokum flughæfni sína. Að skilja hvernig þessi mótandi efnasambönd bindast Nan-Iav mun auðvelda breytingu á núverandi efnasamböndum eða þróun nýrra efnasambanda fyrir áhrifaríkari og...nákvæmMeindýraeyðing. Rannsókn okkar sýnir að Nan-Iav ARD tengiviðmótið er mikilvægt, ekki aðeins til að stjórna virkni innrænna efnasambanda, skordýraeiturs og Ca2+-CaM, heldur einnig fyrir myndun jónagana. Við leggjum til að truflun á myndun tvíliða með litlum sameindum geti verið einstök og efnileg aðferð til að þróa jónaganahemla.
Af átta rétttrúnaðargenunum voru fulllengdargen brúnbjöllunnar (Halyomorpha halys) Nanchung og Inactive valin, sem sýndu framúrskarandi stöðugleika í þvottaefnum. Mynduðu genin voru kódon-fínstillt fyrir tjáningu hjá mönnum og klónuð í pBacMam pCMV-DEST vektorinn (Life Technologies) með því að nota XhoI og EcoRI takmörkunarstaði. Þetta tryggði að klónarnir væru í samræmi við C-enda GFP-FLAG-10xHis og mCherry-FLAG-10xHis merkin, sem eru klofin af HRC-3C próteasa (PPX), sem gerir sjálfstæða starfsemi mögulega.tjáningPraimerarnir sem notaðir voru til að klóna Nanchung og Inactive í pBacMam vektorinn voru eftirfarandi:
Smásjármyndir af einstökum ögnum voru teknar með Titan Krios G2 rafeindasmásjá (FEI) sem var búin K3 myndavél og Gatan BioQuantum orkusíu. Smásjánn var starfræktur við 300 keV, með orkustillingu upp á 20 eV, pixlastærð sýnisins 1,08 Å/pixel (nafnstækkun 81.000x) og ófókushalla á bilinu -0,8 til -2,2 μm. Myndbandsupptaka var gerð við 40 ramma á sekúndu með Latitude S smásjá (Gatan) með nafnskammtahraða 25 e–px⁻¹ s⁻¹, lýsingartíma 2,4 sekúndur og heildarskammt upp á um það bil 60 e–Å⁻².
Leiðrétting á geislavirkri hreyfingu og skammtavigtun voru framkvæmd á filmu með því að nota MotionCor2 í RELION 4.061. Mat á breytum andstæðuflutningsfalls (CTF) var framkvæmt í cryoSPARC með því að nota plástursbundna CTF matsaðferð62. Ljósmyndir með CTF aðlögunarupplausn ≥4 Å voru útilokaðar frá síðari greiningu. Venjulega var notaður hluti af 500–1000 ljósmyndum til að velja punkta í cryoSPARC, og síðan nokkrar umferðir af 2D flokkun eftir síun til að fá skýra viðmiðunarmynd fyrir sniðmátsbundið agnaval. Agnirnar voru síðan dregnar út með 64 pixla afmörkunarkössum og 4-faldri flokkun. Nokkrar umferðir af 2D flokkun voru framkvæmdar til að fjarlægja óæskilega agnaflokka. Upphaflega 3D líkanið var endurgert með ab initio endurgerð og fínpússað með óeinsleitni í cryoSPARC. 3D flokkun var framkvæmd í cryoSPARC eða RELION byggt á ARD ólíkleika. Engin marktæk ólíkleiki í himnusviðum kom fram. Agnirnar voru fínpússaðar með C1 og C2 aðferðunum; Agnir með hærri C2 upplausn voru taldar samhverfar miðað við C2 og fluttar inn í RELION fyrir Bayesíska fínpússun. Agnirnar voru síðan fluttar aftur í cryoSPARC fyrir loka ójafna og staðbundna fínpússun. Lokaupplausn og agnafjöldi er sýndur í töflu 1.
Við vinnslu Nan+AP pentamera könnuðum við ýmsar aðferðir til að bæta upplausn himnuléna (sérstaklega svitaholasvæðið), svo sem merkjafrádrátt og TMD-grímu. Þessar tilraunir mistókust þó vegna hugsanlega mikillar óreglu í svitaholasvæðinu og heildarfjölbreytni TMD. Lokaupplausnin var reiknuð með því að nota grímu sem var sjálfkrafa búin til með óeinsleitri vinnsluaðferð í cryoSPARC, aðallega miðað á ARD svæðið. Þetta náði marktækt hærri upplausn en himnulénanna (sérstaklega VSLD svæðið).
Upphafleg de novo líkön af apo formum Nanchung og óvirkra baktería voru fyrst búin til með Coot63, og líkön af Nan og Iav bakteríunum voru búin til með AlphaFold264 til að bera kennsl á svæði með lágt öryggisstig. Kalmódúlín líkanagerð var byggð á stífum líkamspassum Ca2+-bindandi og Ca2+-lausra líkana í PDB aðgöngumiðlunum 4JPZ56 og 1CFD65, talið í sömu röð. Líkönin voru fínstillt með kúlulaga fínstillingu til að tryggja rétta rúmefnafræði og góða rúmfræði. Fosfatidýlkólín, fosfatidýletanólamín og fosfatidýlserín voru síðan líkönuð sem vel skilgreind lípíðþéttleiki, og NAM og AP bindlarnir voru settir í samsvarandi þéttleika í þéttu tengipunktunum. Takmörkunarskrár voru búnar til úr SMILES streng ísóformanna með því að nota eLBOW í PHENIX66. Að lokum voru líkönin fínstillt í raunrými í PHENIX með því að nota staðbundna grindarleit og alþjóðlega lágmörkun með annars stigs byggingartakmörkunum. MolProbity netþjónninn var notaður til að fínpússa líkanið og burðarvirkisgreiningu og myndskreytingar voru gerðar með PyMOL og UCSF Chimera X. 67,68,69 Ljósopsgreining var framkvæmd með HOLE netþjóninum,70 og raðvarðveislukortlagning var framkvæmd með Consurf netþjóninum.71
Tölfræðileg greining var framkvæmd með Igor Pro 6.2, Excel Office 365 og GraphPad Prism 7.0. Öll megindleg gögn eru kynnt sem meðaltal ± staðalvilla (SEM). T-próf nemenda (tvíhliða, óparað) var notað til að bera saman tvo hópa. Einhliða dreifigreining (ANOVA) og síðan Dunnett post hoc próf var notað til að bera saman marga hópa. *P< 0,05, **P< 0,01 og ***PGildi < 0,001 voru talin tölfræðilega marktæk eftir gagnadreifingu. Kd- og Ki-gildi og ósamhverf 95% öryggisbil þeirra voru reiknuð með GraphPad Prism 10.
Nánari upplýsingar um aðferðafræði rannsóknarinnar er að finna í samantekt á skýrslunni um náttúrusafnið sem er tengd í þessari grein.
Upphaflega líkanið var smíðað með því að nota kalmódúlínlíkön úr gagnagrunnum PDB 4JPZ og 1CFD. Hnitin hafa verið geymd í Próteingagnabankanum (PDB) undir aðgangsnúmerunum 9NVN (Nan-Iav-CaM án bindils), 9NVO (Nan-Iav-CaM bundið nikótínamíði), 9NVP (Nan-Iav-CaM bundið nikótínamíði og EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM bundið afenidólpýrrólíni og kalsíum), 9NVR (Nan-Iav-CaM bundið afenidólpýrrólíni og EDTA) og 9NVS (Nan pentamer bundið afenidólpýrrólíni). Samsvarandi frystingar-rafeindasmásjármyndir eru geymdar í rafeindasmásjárgagnagrunninum (EMDB) undir eftirfarandi aðgangsnúmerum: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM án bindils), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM flókið með nikótínamíði), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM flókið með nikótínamíði og EDTA), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM flókið með aphidopyrrolíni og kalsíum), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM flókið með aphidopyrrolíni og EDTA) og EMD-49849 (Nan pentamer flókið með aphidopyrrolíni). Óunnin gögn fyrir virknisgreininguna eru kynnt í þessari grein.
Birtingartími: 28. janúar 2026