Plöntu- og sýklaefni
Dr. Pat Brown við Háskólann í Illinois (nú við UC Davis) útbjó kortlagningarstofn fyrir sorghum-tengsl, þekktur sem sorghum-umbreytingarstofn (SCP). Hann hefur verið lýst áður og er safn fjölbreyttra lína sem hafa verið breyttar í ljósónæmari og minni hæð til að auðvelda vöxt og þroska plantnanna í bandarísku umhverfi. 510 línur úr þessum stofni voru notaðar í þessari rannsókn, þó að vegna lélegrar spírunar og annarra gæðaeftirlitsvandamála voru ekki allar línurnar notaðar í greiningu á öllum þremur eiginleikum. Að lokum voru gögn frá 345 línum notuð til að greina kítínsvörunina, 472 línur fyrir flg22 svörunina og 456 fyrir TLS-ónæmi.B. cookeiStofninn LSLP18 var fenginn frá Dr. Burt Bluhm við Háskólann í Arkansas.
MAMP svörunarmæling
Tvær mismunandi MAMP-einingar voru notaðar í þessari rannsókn, flg22 (Genscript vörulistanúmer RP19986) og kítín. Sorghumplöntur voru ræktaðar í innfelldum hlutum sem lagðir voru á flöt fyllt með mold (33% Sunshine Redi-Earth Pro ræktunarblanda) í gróðurhúsinu. Plönturnar voru vökvaðar daginn fyrir sýnistöku til að forðast umfram raka í laufblöðunum á söfnunardegi.
Línurnar voru slembiraðaðar og, af skipulagsástæðum, gróðursettar í hópum með 60 línum. Fyrir hverja línu voru þrír „pottar“ gróðursettir með tveimur fræjum í hverri línu. Síðari hópar voru gróðursettir um leið og fyrri hópurinn hafði verið unninn þar til allur stofninn hafði verið metinn. Tvær tilraunakeyrslur voru gerðar fyrir báða MAMP-hópana þar sem arfgerðirnar voru endurraðaðar slembiraðaðar í hvorri keyrslu.
ROS próf voru framkvæmd eins og áður hefur verið lýst. Í stuttu máli voru sex fræ gróðursett í þrjá mismunandi potta fyrir hverja línu. Úr þeim plöntum sem komu út voru þrjú valin út frá einsleitni. Ekki voru notaðar plöntur sem litu óvenjulegar út eða voru marktækt hærri eða lægri en meirihlutinn. Fjórar laufblöðkur með 3 mm þvermál voru skornar út úr breiðasta hluta fjórða blaðsins af þremur mismunandi 15 daga gömlum sorghumplöntum. Einn blaðplata á hvert blað frá tveimur plöntum og tveir blaðplatar frá einni plöntu, þar sem seinni blaðplatan varð vatnsviðmiðun (sjá hér að neðan). Diskarnir voru settir hver fyrir sig á fljótandi 50 µl af H2O í svörtum 96 hola plötu, innsiglaðir með álinnsigli til að forðast ljós og geymdir við stofuhita yfir nótt. Næsta morgun var útbúin lausn til að meðhöndla hvarfefnið með því að nota 2 mg/ml efnaljómandi rannsaka L-012 (Wako, vörulistanúmer 120-04891), 2 mg/ml piparrótperoxídasa (gerð VI-A, Sigma-Aldrich, vörulistanúmer P6782) og 100 mg/ml kítín eða 2 μM af Flg22. 50 µl af þessari lausn voru bætt í þrjá af fjórum holum. Fjórði holinn var eftirlíkingarviðmiðun, þar sem lausnin án MAMP var bætt við. Fjórir auðir holar sem innihéldu eingöngu vatn voru einnig í hverri plötu.
Eftir að hvarflausninni var bætt við var ljóminn mældur með SynergyTM 2 fjölgreiningarörplötulesara (BioTek) á 2 mínútna fresti í 1 klst. Plötulesarinn tekur ljóminnmælingar á 2 mínútna fresti á þessum 1 klst. Summa allra 31 mælinga var reiknuð til að fá gildið fyrir hvern brunn. Áætlað gildi fyrir MAMP svörun fyrir hverja arfgerð var reiknað sem (meðal ljóminnkunargildi tilraunabrunnanna þriggja - gildi gervibrunnsins) - mínus meðalgildi auða brunnsins. Gildi auða brunnanna voru stöðugt nálægt núlli.
Laufdiskar afNicotiana benthamiana, ein sorghumlína með góðri svörun (SC0003) og ein sorghumlína með lítilli svörun (PI 6069) voru einnig notaðar sem samanburðarhópar í hverri 96 hols plötu til gæðaeftirlits.
B. cookeiUndirbúningur og bólusetning í bóluefni
B. cookeiSáðefni var útbúið eins og áður hefur verið lýst. Í stuttu máli voru sorghumkorn lögð í bleyti í vatni í þrjá daga, skoluð, sett í 1 lítra keiluflöskur og gufusæfð í klukkustund við 15 psi og 121°C. Kornin voru síðan sáð með um 5 ml af maukaðri sveppaþörunga úr ferskri ræktun afB. cookeiLSLP18 einangruð efni voru sett í tvær vikur við stofuhita, flöskurnar hristar á þriggja daga fresti. Eftir tvær vikur voru sveppasýkingar af sorghumkornunum loftþurrkaðar og síðan geymdar við 4°C þar til þær voru bólusettar á akri. Sama sýkingin var notuð í allri tilrauninni og gerð fersk á hverju ári. Til sýkingarinnar voru 6–10 sýkingar af kornunum sett í 4–5 vikna gamla sorghumplöntur. Gróin sem mynduðust úr þessum sveppum ollu sýkingu í ungu sorghumplöntunum innan viku.
Undirbúningur fræja
Áður en sorghumfræ voru gróðursett í akri voru þau meðhöndluð með blöndu af sveppaeyði, skordýraeitri og öryggisefni sem innihélt um 1% Spirato 480 FS sveppaeyði, 4% Sebring 480 FS sveppaeyði og 3% Sorpro 940 ES fræöryggisefni. Síðan voru fræin loftþurrkuð í 3 daga sem myndaði þunnt lag af þessari blöndu utan um fræin. Öryggisefnið gerði kleift að nota illgresiseyðið Dual Magnum sem meðferð fyrir spírun.
Mat á viðnámi gegn markblöðum
SCP var plantað á Central Crops Research Station í Clayton, Norður-Karólínu, dagana 14.-15. júní 2017 og 20. júní 2018 í slembiraðaðri heildarblokkarhönnun með tveimur tilraunaendurtekningum í hvoru tilfelli. Tilraunirnar voru plantaðar í 1,8 m stakar raðir með 0,9 m raðbreidd með því að nota 10 fræ í hverjum reit. Tvær jaðarraðir voru plantaðar meðfram jaðri hverrar tilraunar til að koma í veg fyrir brúnaáhrif. Tilraunirnar voru sáðar 20. júlí 2017 og 20. júlí 2018, og þá voru sorghumplönturnar á vaxtarstigi 3. Einkunnir voru teknar á kvarða frá einum til níu, þar sem plöntur sem sýndu engin merki um sjúkdóm voru metnar sem níu og alveg dauðar plöntur voru metnar sem einn. Tvær einkunnir voru teknar árið 2017 og fjórar mælingar árið 2018, byrjað tvær vikur eftir ígræðslu ár hvert. sAUDPC (staðlað flatarmál undir sjúkdómsframvinduferli) var reiknað eins og áður hefur verið lýst.
Birtingartími: 1. apríl 2021